基因治疗人类crb1突变引起的视网膜色素变性的方案探索-眼科学专业论文.docxVIP

浙江大学硕士学位论文 浙江大学硕士学位论文 中文摘要 基因治疗人类CRBl突变引起的 视网膜色素变性的方案探索 浙江大学医学院 眼科学 硕士研究生 闫晨曦 导 师 姚克教授 中文摘要 目的： 感光细胞退行性病变是人类的一种常见致盲性疾病，严重危害人类健康，但 目前针对这类疾病仍没有良好的医疗手段。现今，基因治疗和干细胞治疗是两类 具有较好前景的治疗方案。在人类诸多与视网膜退行性病变相关的基因当中， CRBl基因不同位点的突变可以引起视网膜色素变性(Retinitis pigmentosa，RP) 和利伯氏先天性黑蒙(Leber congenital amaurosis，LCA)，但目前尚未有关于此基 因突变进行基因治疗的报道，主要原因之一是CRBl基因比较大，不符合基因治 疗的载体腺相关病毒(Adeno—associated virus，AAV)对基因片段大小的要求，且 其编码的蛋白质结构复杂，各结构域的功能尚不十分明确。鉴于此，本论文旨在 以斑马鱼为模型，分析其Crb2a蛋白各结构域的功能，在此基础上探索对人类因 CRBl功能缺陷引起的RP和LCA的基因治疗方案。 方法： 首先，通过生物信息学比较斑马鱼不同Crb异构体与哺乳动物CRBl之间的 同源性，确定crb2a为斑马鱼中与哺乳动物CRBl同源的基因。然后，对斑马鱼 II 万方数据 浙江大学硕士学位论文 浙江大学硕士学位论文 中文摘要 Crb2a蛋白的各结构域分区进行预测，结合对比分析自然界原本存在的不同异构 体，分别克隆各单个结构域或结构域组合，在斑马鱼和细胞中分别检测其对crb2a 突变鱼系表型的修复情况，介导蛋白一一蛋白自身粘连的能力等，以此研究Crb2a 各结构域的功能。在此基础上，选择基因大小适宜且保留Crb2a功能的重组形式， 通过转基因技术在斑马鱼中验证对CRBl突变引起的视网膜疾病进行基因治疗的 可行性。 结果： 生物信息学分析表明，crb2a具有3个Laminin G结构域和16个EGF结构域。 同时，尽管自然界中获得广泛认可的具有功能的Crb蛋白通常由以上结构域组成， 但cDNA克隆表明crb2a具有多种不同的剪接转录形式。．在此基础上，我们通过 基因工程技术，获得了8种不同结构域组合的重组crb2a。经体外转录成mRNA 后，显微注射到斑马鱼胚胎中，观察是否能修复crb2a突变鱼系表型。结果证明 了Crb2a的各个结构域具有相对独立功能，不同重组形式的Crb2a在不同的脏器 展现出不同的修复效果。 结论： 本研究初步证明crb2a的多个结构域具有相对独立功能，通过重组crb2a基 因，有望获得基因大小合适AAV载体，且能保留全长crb2a基本功能的修改形式， 为基因治疗人类与CRBl相关的疾病提供新的条件。 关键词：视网膜色素变性，利伯氏先天性黑蒙，Crb蛋白，蛋白结构域，斑马鱼， 基因重组，基因治疗 III 万方数据 浙江大学硕士学位论文 浙江大学硕士学位论文 英文摘要 The exploration of gene therapy of retinitis pigmentosa caused by mutation of human CRBl Medical College of Zhejiang University Master Candidate Y．an Chenxi Supervisor Professor Yao Ke Abstract Purpose： Degeneration of photoreceptor cells is a common cause of blindness，which could bro