华支睾吸虫六个未知基因的识别及pgk1和pgk2的生物学特性分析-病原生物学专业论文.docxVIP

吴德博士学位论文 吴德博士学位论文 _中文捕要 华支睾吸虫六个未知基因的识别及PGKl 和PGK2的生物学特性研究 专 业：病原生物学 博士研究生：吴德 导 师：余新炳教授 摘要 华支睾吸虫病(ClonochiasJs)又叫肝吸虫病，是由华支睾吸虫感染所引起 的一种人兽共患病。它主要分布在东南亚，我国是主要的流行区之一。两次全国 寄生虫病的调查结果显示华支睾吸虫病呈明显上升趋势。目前，我国除西藏、内 蒙、甘肃、宁夏、新疆等少数省市外，至少有24个省的200多个县或地区有该 病的流行。其中，广东、广西最为严重。 华支睾吸虫主要寄生在宿主的肝胆管内，通过摄取宿主的葡萄糖进行糖酵解而 获取能量。虫体的代谢产物及虫体本身的机械性刺激，可引起肝胆管，特别是次级 胆管的炎症反应。中度感染胆管可出现局限性扩张，管壁增厚，管腔狭窄。如合并 细菌感染，可引起胆管炎和胆管肝炎，周围纤维组织增生，晚期可发生肝硬化。虫 卵、死亡的虫体及其碎片可能构成结石的核心，诱发结石症。越来越多的证据表明， 华支睾吸虫感染可使原发性肝胆管癌患病率增加。华支睾吸虫病的诊断主要以病原 学诊断和血清学诊断为主，但作为综合防治的重要手段之一，目前仍缺乏一种快速、 敏感和特异的诊断方法，因此利用基因工程技术寻找特异性抗原诊断分子仍是华支 睾吸虫病研究的重要内容。华支睾吸虫病治疗的主要有效药物是毗喹酮和阿苯哒 唑，但由于长期使用和病人的重复感染，可能会导致耐药虫株的出现，所以利用分 子生物学方法寻找新的药物靶点是华支睾吸虫研究的另一个重要方向。到上个世纪 末，人们对华支睾吸虫的认识仍局限于形态学及其流行病学的调查，这种认让泳不 能彻底了解华支睾吸虫的发生、发展规律及其致病的机制。磷酸甘油酸激酶 (phosphoglycerate kfnase PGK)是糖酵解的关键酶，也是每种生物得以生存 吴德博士学位论文 吴德博士学位论文 中文摘要 的必须酶，该酶的缺乏町引起生物体代谢等功能的紊乱。PGK是一个单体的、高 度柔曲性的酶，它主要由两个球形的结构阈构成，在与底物结合的过程中发生显 著的构象改变，最终产生催化效应。该酶在一些细菌细胞中只有一种，而在大多 数生物体内则含2—3种同工酶，这些同工酶不仅在生物体内的分布不一样，还表 现出独特的生物学功能。PGK存在于所有的有机生命中，在整个进化过程中，它 的序列是高度保守的，因此有人利用这一特点来绘制进化树从而对物种进行分类 研究。磷酸甘油酸激酶是厌氧牛物包括肿瘤细胞存内的有机生物获取能量的关键 酶，抑制它的功能将会引起这些生物的代谢紊乱。二硫化物还原酶功能是磷酸甘 油酸激酶的另一个重要功能，在生物体内它呵以触发血管抑制因子一血管抑素的 释放，从而间接的抑制肿瘤的生长，所以它被认为是一个很好的肿瘤抑制物。此 外，磷酸目’油酸激酶还有调控尿激酶型的纤溶酶原激活受体的表达，引起肿瘤耐 药。同时还具有影响哺乳类细胞核内DNA复制和修补以及刺激病毒信使RNA的合 成等生物学功能。华支睾吸虫的两个磷酸甘油酸激酶同工酶基因最近eJ+被发现， 通过对它们的研究和探讨用以了解其在华支睾吸虫中的作用及其可能的应用价 值。 研究目的 通过筛选华支睾吸虫成虫eDNA质粒文库，发现并识别未知的全长基因。 在此基础上，对新发现的华支睾吸虫磷酸甘油酸激酶同工酶基因进行克隆、表达 和纯化分析，并研究其生物学活性：包括免疫原性、免疫反应性，组织分布，酶 活性及对肝癌生长的抑制作用。同时研究这两个同工酶在虫体中的差异表达和进 化分析，以探讨这两个同工酶在华支睾吸虫q1的作用和可能的应用价值。 研究方法 l_华支睾吸虫成虫eDNA文库的筛选及组织结构分析 根据文库载体设计引物，以文库克隆为模板进行PCR扩增筛选，对500bp以 上的PCR产物进行测序，再将测序所获得的EST归并，同时将归并的序列登录生 物信息学网站进行蛋白质的结构和功能分析。包括ORF识别、核酸和氨基酸序列 II 吴德博士学位论文 吴德博士学位论文 中文摘要 同源性比对、保：j区预测、线粒体靶向序列分析、跨膜区及信号肽剪切位点的预 测、蛋白质指纹的认定、进化树的绘制，同时对这些假想蛋白的理化性质及二级 结构和高级结构进{J二推断。 2．华支睾吸虫两个P G K同工酶差异性表达的研究 用Trizol法抽提华支睾吸虫成虫总RNA，并反转录成cDNA，根据两个PGK 同工酶基因序列的差异设计两对引物，利用荧光定量PCR方法对华支睾吸虫成虫 cDNA进行实时定量分析，比较这两个同工酶在虫体内的表达差异． 3．华支睾吸虫六个基因的