细胞培养操作及其注发意事项.pptVIP

细胞培养操作及其注意事项;一 、准备工作;二、贴壁细胞的换液及传代;2. 传代 当细胞密度达到70%-80%时，需要进行传代。 ?吸弃或者倒弃原培养液。 ?加入适量PBS以漂洗除去残余的原培养液。 ?加入适量的胰蛋白酶，混匀后放置培养箱37℃孵育1-3分钟。 ?观察细胞消化情况。 ?加入完全培养基以终止消化。 ?按比例把细胞传到新的培养皿中。→放置细胞培养箱中培养。;注意： ?判断细胞是否要传代的准则是不能让细胞生长密度大于80%。 ?血清中有抑制胰蛋白酶的成分。加入的胰蛋白酶的量不能太多，只要稍微能覆盖细胞层面即可。若加入的胰蛋白酶较多，会伤害细胞且有可能反而降低消化效率。 孵育时间不能过长，否者对细胞照成伤害。一般来说1-3分钟足够，尽量不要超过5分钟。 贴壁较牢固的细胞株（如4T1细胞株），需要孵育时间较长，而贴壁不牢固的细胞株（如Hela 细胞株），需要孵育时间较短。一般来说，细胞生长密度较大时，需要孵育时间较长。 ?不需要专门离心以去除胰蛋白酶，加入完全培养基即可。若需要去除胰蛋白酶，可离心弃上清以除去胰蛋白酶。 ?根据细胞生长速度的不同选择不同的传代比例。 ?尽量不要使用原培养皿，因为经胰蛋白酶处理后的培养皿表面涂层会发生变化，会在一定程度上影响细胞的性状。 ;三、细胞计数及存活率检测;计数池两侧各有一支持柱，将特制的专用盖玻片覆盖其上，形成高0.10mm的计数池。计数池划有长、宽各3.0mm的方格，分为9个大格，每个大格面积1.0mm2。容积为0.1mm3，其中，中央大方格用双线双成25个中方格，位于正中及四角5个中方格是红细胞计数区域，用单划线分为16个中方格。 当遇到位于大格线上的细胞，一般只计数大方格的上方和右方线上的细胞。 计算公式 细胞数（4个角大方格区域内的细胞数之和/4)×104×稀释倍数×细胞悬液总体积 细胞计数板用后要清洗，切勿用硬物洗刷。; 细胞存活率检测;四、细胞冻存;五、细胞复苏;六、操作完处理;