质粒dna的来提取-1.pptVIP

质粒DNA的提取 小组成员：卜斌、王桂平、陈茜 柳文祥、王宣高 什么是质粒（plasmid）？ ?? 质粒是染色体外的稳定遗传因子 ?? 大小1-200Kb ?? 双链、闭环、超螺旋DNA ?? 主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中 ?? 自主复制和转录，并表达所携带的遗传信息。 碱裂解法抽提质粒DNA基本原理： 利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异实现质粒的分离。 溶液Ⅰ：葡萄糖（50mmol/L）；Tris·HCl（ 25mmol/L， pH8.0） 低浓度的葡萄糖溶液使细胞处于低渗状态而细胞澎胀； 葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏DNA。 EDTA的作用是螯合掉Mg2+、Ca2+等二价金属离子，防止DNA酶对质粒分子的降解作用。 Tris?Cl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围。 溶液Ⅱ： NaOH （0.2mol/L） ；SDS （ 1%，新鲜配制） 溶液II：SDS的作用：破坏细胞膜；解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性。 NaOH(pH12)的作用：破坏氢键，使DNA分子变性。 溶液Ⅲ： 60ml的5mol/L KAC ； 11.5ml的冰醋酸； 28.5ml水 溶液III：由KAc与HAc组成，是pH值为5.5的高盐溶液。能中和溶液II的碱性， 使DNA复性。K+离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。 溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质，很容易与小 分子的质粒DNA分离。 * * 基本原理： 1.掌握碱裂解法提取质粒的原理 2.了解实验中所使用的试剂的作用 技术操作: 1.碱裂解法抽提大肠杆菌质粒DNA 染色体DNA与质粒DNA 双螺旋结 构解开 氢键断裂， 保持双螺旋 沉淀物 可溶状态 大部分细胞碎片、 染色体DNA、RNA及蛋白质 上清中的质粒 质粒DNA 酚氯仿 抽提 NaOH和SDS溶液 裂解变性 加入中和液 迅速复性 在高盐浓度下，染色体DNA交联形成不溶性网状结构并与蛋白质-SDS复合物等形成沉淀 * * *