华支睾吸虫三个胞质gst基因的表达及功能研究-病原生物学专业论文.docxVIP

伍忠銮博士学位论文 伍忠銮博士学位论文 中文摘要 生性蠕虫以胞质GSTs为主，参与对由虫体代谢和宿主免疫系统所产生的脂质过 氧化物和细胞毒性的羰基的解毒，对虫体的生存起重要的作用，是免疫疗法、化 学疗法和免疫诊断潜在的靶标。 目前国内外对华支睾吸虫GSTs家族的基因结构与功能知之甚少，因而，发 现这个家族新的编码基因并研究它们的功能对于明确华支睾吸虫GSTs家族的特 点和功能具有重要意义，也为寻求更好的诊断和治疗措施提供理论依据。 研究目的解析三个胞质GSTs的基因结构及其特点，克隆三个胞质GSTs基因， 鉴定原核表达的重组GSTs的免疫反应性、免疫原性、催化活性及其免疫定位和 抑制剂、常用抗寄生虫药对催化活性的影响。 研究方法从华支睾吸虫成虫eDNA文库随机测序得到的全长Unigcne中识别出 三个编码胞质GSTs的基因一／．t型谷胱甘肽转移酶(mu-class glutathione transferase，GSTM)、谷胱甘肽转移酶l(glutathione transferase l，GSTl)和谷 胱甘肽转移酶2(glutathione transferase 2，GST2)基因。用生物信息学方法对其 进行结构预测及其三者之间的同源性比较，用PCR方法从成虫cDNA文库和基因 组中扩增、测序，定向克隆到原核表达载体pET-30a《+)，在大肠杆菌BL21／DE3 表达，按照Ni．NTAAgarose说明书纯化重组蛋白，用十二烷基硫酸钠．聚丙烯酰 胺凝胶电泳(SDS．PAGE)和薄层色谱(TLC)分析。用华支睾吸虫病人血清进行免疫 印迹鉴定纯化蛋白质的免疫反应性。用纯化蛋自质免疫昆明小鼠取得韵血清分别 进行免疫印迹和间接免疫荧光分析(IIFA)鉴定纯化蛋白的免疫原性和免疫定位。 用GSTs的通用底物2，4-二硝基氯苯(CDNB)鉴定重组蛋白的酶催化活性，并观 察其特异性挪南蛴4汽巴蓝和常用的抗寄生虫病药阿苯达唑、毗喹酮和青蒿琥酯对 三个重组GSTs的活性的影响。 研究结果 1、华支睾吸虫GSTM基因全长657 bp，没有内含子，编码218个氨基酸，氨基 酸序列的理论分子量(Mw)为25．028 ld3a，等电点(pD为6．07。它与华支宰 吸虫ll型GST的同源性最高，核苷酸、氨基酸序列的同源性分别为99％和98％。 测序证实GSTM核苷酸与华支睾吸虫ll型GST之间存在三个碱基的差异。GSTM 氨基酸序列与人u型GST的同源性为43％，与肝片吸虫u型GST、曼氏血吸虫 OST和大片吸虫GST的同源性分别为64％、62％和62％。它具有GSTs完整的 保守功能域：在第3—77位氨基酸存在GSTN-末端功能域，在第88—187位氮基酸 H 堡查垄竖主兰堡鲨奎 堡查垄竖主兰堡鲨奎 ±塞塑茎 存在GST C．末端功能域。 2、GSTl基因全长642 bp，没有内含子，编码213个氨基酸，氨基酸序列的理 论MW／pI为24．650 kDa／5．22。氨基酸序列与麝猫后睾吸虫GST同源性最高 (88％)，与华支睾吸虫28 kDaGST的同源性为60％，与人造血前列腺素D合 酶、GSTPI—l和GSTⅡ3的同源性分别为29％、23％和24％。与埃及血吸虫28 kDa GST、牛血吸虫28 kDa GST、曼氏血吸虫28 kDa GST、日本血吸虫28 kDa GST、 肺吸虫28 kDa GST、蛔虫。型GST、秀丽线虫GST-14和爪蟾GST的同源性分 别为45％、45％、45％、44％、38％、31％、31％和32％。GSTl氨基酸序列具有 GSTs的完整的保守功能域：在第5培2位氨基酸存在GSTN．末端功能域，在第 111—195位氨基酸存在GST C．末端功能域。 3、GST2基因全长639 bp，没有内含子，编码212个氨基酸，氨基酸序列的理 论MW／pI为24．346 kDa／6．97。氨基酸序列与华支睾吸虫28 kDa GST的同源性最 高(61％)，与麝猫后睾吸虫GST的同源性为56％，与人造血前列腺素D合酶和 GSTM3的同源性分别为30％和29％，与日本血吸虫28 kDaGST、埃及血吸虫 28 kDaGST、牛血吸虫28 kDaGST、曼氏血吸虫28 kDaGST、肺吸虫28kDaGST 和秀丽线虫GST3的同源性分别为39％、39％、39％、38％、36％和28％。GST2 氨基酸序列具有GSTs的完整的保守功能域：在第8-81位氨基酸存在GST N．末 端功能域，