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第17章基 因 治 疗 Gene therapy 孙 健 第一节 概述 基因治疗（Gene therapy） 指通过在特定靶细胞中表达该细胞本不表达的基因或采用特定方式关闭、抑制异常表达基因，达到治疗疾病的目的。 基因治疗研究的主要内容或策略 （一）基因标记（gene labeling） 验证外源基因是否安全转入患者体内，患者体内细胞有是否转移基因 标记方法：将含有neo基因的重组逆转录病毒载体在体外转染细胞，然后输入体内 （二）基因置换(gene replacement) 又称基因矫正（gene correctiong)，指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，以导入的正常基因取代基因组内有缺陷的基因，不涉及基因组其它改变。 必要条件 导入基因及其产物有详尽了解 外来基因能有效导入靶细胞 导入基因能在靶细胞中长期稳定驻留 导入基因有适度表达 基因导入的方法与所用载体对宿主安全无害 （三）基因添加（gene augmentation） 导入外源基因使靶细胞表达本身不表达的基因。分两类 导入正常基因 缺陷基未删除，导入的正常基因整合到基因组中并表达，从而补偿缺陷基因功能 导入靶细胞本来不表达的基因 例如将某种细胞因子基因导入肿瘤细胞，利用其表达产物进行治疗 （四）基因干预（ gene interference） 采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因使之不表达，以达到治疗的目的 常用的方法是采用反义核酸或反义核酸加核酶。此类基因治疗的靶基因往往是过度表达的癌基因或病毒基因 第二节 基因转移技术和靶细胞 基因治疗的方式 体内法 体内直接转基因 回体法 细胞介导的基因治疗 基因转移的方法 生物学方法 非生物学方法 第二节 基因转移技术和靶细胞 一 基因转移的生物学方法 1.载体 有逆转录病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体，单纯疱疹病毒载体。经改造，删除编码功能蛋白基因，保留顺式作用区（与复制，整合，转录，包装有关），无致病性 包装细胞 packaging cell 系 是将缺失了包装信号及相关序列的缺陷型逆转录病毒（辅助病毒）导入哺乳动物细胞而制备成的一种特殊细胞系。这种细胞因携带有逆转录病毒基因组而能大量产生病毒包装蛋白，而辅助病毒缺乏包装信号（ψ序列）而不能包装 逆转录病毒载体导入包装细胞后，插入基因组。由逆转录病毒转录出的RNA，只含有病毒基因组的部分序列及标记基因和目的基因的转录产物，同时还具有包装信号。这种病毒颗粒只具有一次感染性，感染其它细胞后，不能产生新的病毒颗粒，称为假病毒颗粒 （pseudoviral particles）。假病毒颗粒可分泌到包装细胞的培养上清中，具有对靶细胞的感染能力。 逆转录病毒载体的特点 假病毒颗粒RNA不含逆转录病毒结构基因，被目的基因和标记基因取代 具有感染靶细胞的能力 能通过逆转录过程转变成前病毒，并整合于宿主细胞的染色体上 转化宿主细胞，并稳定表达导入基因 靶细胞不含病毒的包装序列，因而不会产生新的完整病毒颗粒 逆转录病毒载体用于基因治疗的安全性 逆转录病毒感染的可能性：不能完全排除 污染的可能性：操作过程污染 逆转录病毒在靶细胞基因组的整合：随机整合 二 基因转移的非生物学方法 脂质体（liposome）：人工方法使磷脂在水中形成磷脂双层包裹目的基因，静脉注射，将目的基因导入靶细胞 直接注射：将裸露DNA直接注入肌肉内 受体介导基因转移技术：制成配体多聚赖氨酸复合物，利用配体与细胞膜受体的识别作用，被吞噬入细胞。若所携带目的基因的载体适当，即可在细胞中表达 三 基因转移的靶细胞 目前仅限于体细胞，严禁使用生殖细胞作靶细胞 作为靶细胞的条件：有组织特异性；细胞易获得；体外易培养；植入体内易成活 造血细胞 由于造血干细胞量少难培养，因此，对骨髓细胞的基因转移实验主要是将基因转移到未分离的骨髓细胞，如果转移4个月后骨髓和淋巴细胞组织内仍有转移基因的存在或表即认为转染成功。 皮肤成纤维细胞 肝细胞 血管内皮细胞 淋巴细胞 肌肉细胞 肿瘤细胞 反义RNA（antisense RNA） Antisense RNA可与mRNA配对成双链，也可与引物RNA互补从而抑制翻译和复制过程。目前，用于基因治疗的方法主要是受体介导的Antisense RNA转移技术。 反义RNA（antisense RNA） 受体介导Antisense RNA转移技术 应用前景 安全性高 Antisense RNA设计和制备方便 有剂量调节效应 能直接作用于RNA病毒 核酶（ribozyme） 核酶的设计：用于基因治疗的核酶分子由三部分组成，中间是保守序列（能够组成酶活性的结构域），两端为引导序列（guide sequences）。引导序列随靶序列的碱基组成而变 导入方法：外源导入、内