质谱分到析技术.pptVIP

用于蛋白质鉴定的两种基本的质谱分析技术;2）SELDI-TOF MS Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization 表面增强激光解吸附离子化 MW: 2,000-50,000 3）MS/MS Tandem MS串连质谱技术 MW: 200-3,000;1）MALDI-TOF MS（原理示意图）;用MALDI-TOF MS和数据库鉴定细菌蛋白GroEL;PMF肽质量指纹谱鉴定蛋白质例子;Myoglobin用胰蛋白酶限制酶切后产生的肽段（从碱性氨基酸的羧基端切断）;胰蛋白酶酶切Myoglobin产生的肽段及其分子量;实际质谱分析所得的肽质量指纹谱;2）SELDI-TOF MS （原理示意图） ;SELDI-TOF MS分析使用的各种蛋白质芯片;SELDI-TOF MA检测结果与处理;实例：鼻咽癌病人血清标志物检测;卵巢癌细胞培养液上清中分泌蛋白的SELDI-TOF MS检测分析;2）MS/MS串连质谱分析原理示意图;限制酶切蛋白质为肽段;第一步MS分离各个肽段第二步MS对其中的一个肽段进行氨基酸序列分析;碰撞诱导解离CID中多肽分子结构中键断裂的多种可能性;控制CID过程中的能量，使多肽主要从最弱的键---肽键处断裂产生N-端b系列和C-端y系列肽段;串联质谱氨基酸序列分析例子肽段SGFLEEDELK在理想条件下可生成的b、y系列离子;先找出y系列离子;再找出b系列离子;新序列推测;新序列推测2;新序列推测原则软件辅助分析;六、质谱分析技术在医学生物学中的应用1、蛋白质鉴定： 用于多肽，蛋白质的分子量测定外，还广泛的应用于肽指纹图谱测定及氨基酸序列测定。1）直接通过末端氨基酸序列分析鉴定蛋白质2）结合肽谱数据库鉴定蛋白质（肽质量指纹谱）3）蛋白质修饰鉴定;用MALDI-TOF MS检测特定部位氨基酸残基的磷酸化;4）分子量测定： MALDI-TOF 的准确度高达0.1%~0.01%，远远高于目前常规应用的SDS 电泳与高效凝胶色谱技术，目前可测定生物大分子的分子量高达300KDa。 5） 另外分子量测定还可以提供分子结构信息：（1）分子式(样品的元素组成)用同位素丰度比法（低分辨法）或高分辨质谱仪测得的准确相对分子质量，均可以确定分子式；（2）鉴定某些官能团如甲基(m/z 15)、羰基(m/z 28)、甲氧基(m/z 31)、乙酰基(m/z 43)……（3）分子结构信息由分子结构与裂解方式的经验规律,根据碎片离子的m/z 及相对丰度RA 提供分子结构信息。;2、质谱峰图谱比较：用于混合物比较 如血、尿、分泌液中的代谢物（ 大分子和小分子）等改变的监测，可以用于生物标记物分析鉴定，作为生物药材的鉴定，监测疾病过程，治疗效果，预后评价，各种生理病理过程研究的监测和评估3、质谱分析方法的选择 1）质谱峰图谱比较： SELDI-TOF MS 2 kDa – 50 kDa MALDI-TOF MS 0.8 kDa – 300 kDa 2）蛋白质鉴定： MALDI-TOF MS PMF 串联质谱（MS-MS）氨基酸序列分析;七、基本过程与样品制备注意事项;3）胶内蛋白酶限制酶切，从此步骤可由公司完成4）肽段提取纯化，点样5）质谱分析数据获取（质谱仪器分析）6）数据信息解读 人工：氨基酸序列分析（可以自己人工分析） 软件处理：蛋白质鉴定、氨基酸序列分析网站：/tools/#proteome 可以选择转向相关网站软件：MASCOT等适用于PMF和氨基酸序列分析数据库：MSDB、NCBInr、SwissProt;（二）样品制备注意事项; The following components are ACCEPTABLE  Acetic or formic acid, Acetonitrile, ethanol, Guanidine/HCl 4M, Hexafluoroisopropanol up to 40%, Methanol, Sodium chloride 10 mM, Urea 1M ;八、质谱数据分析软件使用（以Mascot为例）