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DEAE — 纤维素梯度层析实验 一 实验原理 DEAE-纤维素是以纤维素为母体接有二乙基氨基乙基（DEAE）活性基团的 弱碱性阴离子交换剂,它在离子交换层析中可用于蛋白质、核酸、激素、酶等 大分子的分离与纯化。对于某些组分比较复杂或性质比较相近的蛋白质样 品。在采用一般的恒溶剂系统进行离子交换柱层析时，往往不容易分离，这 时可采用梯度洗提（装置见图1-2）。即用一定的样品离子在不同的离子强度 （或pH）溶液中对一定的离子交换剂的平衡常数不同，在洗提过程中，通过 不断改变洗提的离子强度pH不变）[根据实验的具体情况，也可同时改变离子 强度和pH]，以逐步改变样品中各组分与离子交换剂的交换能力，最后得到分 离，这种层析方式即称为梯度洗提层析。洗提剂的梯度产生如图所示，当 A1=A2时，产生线形梯度；当A1A2时，产生凹型梯度；当A1A2时，产生凸型 梯度。不同的样品，应根据实验情形，选择合适的梯度洗提曲线（见附1） 。 梯度洗脱示意图 二 实验目的与要求 通过DEAE-纤维素阴离子交换剂，采 用一条线型离子强度和恒定pH洗提曲线， 对鸡蛋白蛋白（CEA）粗制样品进行分级 分离，以了解梯度洗提的层析方法。 三 实验主要器材与装置 3-1、实验仪器 （1）、色谱工作站及装置 （2）、笔记本电脑 （3）、紫外检测仪 （4）、梯度混合仪 （5）、恒流泵 3-2、实验器材 （1）、 层析柱 （2）、 烧 杯 （3）、 可调取液器 （4）、 量 筒 （5）、 玻 棒 （6）、 标签纸 （7）、 记号笔 （8）、 洗耳球 3-3、实验装置图 四 试剂与配制 4- 1 ．实验试剂 （1）、三羧甲基氨基甲烷（Tris） （2）、鸡蛋白蛋白（CEA） （3）、DEAE-52 （4）、盐 酸 （5）、氯化钠 4-2．试剂配制 （1）、Buffer A（20mM pH8.0 Tris-HCl ）的配制： 称取Tris 60.7mg ，于一烧杯中，先加少量蒸馏水溶解，然后用稀 HCl调至pH8.0，最后加蒸馏水稀释至100毫升，混匀即可。 （2）、Buffer B的配制： 取Buffer A 50毫升，加氯化钠（1.0M）2.9克，溶解混匀即可。 （3）、CEA样液的配制： 20.0mg CEA+1ml Buffer A 五 方法与步骤 1 树脂的处理 2 装 柱 [ 柱 高 10.0cm ] 3 平 衡 [ 流 速 0.8 ml / mi n; 30.0 min ] 4 上 样 [ 上样体积 1.0ml ] 5 洗 涤 [ 1.0ml×2次; 再自动洗涤15 min ] 6 洗 脱 [ 梯度混合仪 A – B杯,各倒入 A - B溶液60ml 最后一个峰已回到基线时，继续洗脱10分钟 ] 7 收 集 8 测 定 思考题 1、DEAE-纤维素最佳吸附PH范围是多少？ 2、DEAE-纤维素再生最适酸、碱浓度是多少？ * * * *