基因工程题pcr.pptVIP

第四节 DNA聚合酶链式反应 PCR技术是一种模拟DNA体内复制过程的体外DNA复制过程，在一个离心管的缓冲液体系中，加入DNA模板，dNTPs, 引物和DNA聚合酶，然后通过变性、退火、延伸三个温度的不断循环，使得目标DNA得到快速大量的复制。 PCR技术已经广泛应用于科学研究和医疗事业，比如DNA的克隆，序列分析，医学诊断以及生物系统发生科学的研究等。 反应需要两条合成的寡核苷酸片段和耐热的DNA聚合酶。一般用Taq DNA聚合酶，是从栖热水生菌（Thermus aquaticus ）中提取出来的。 两条引物分别和正义链和反义链的 3’ 端结合，然后朝着彼此的3’-OH 方向延伸。 Polymerase Chain Reaction（PCR） Polymerase Chain Reaction（PCR） 94 72 56 反应的第一步是加热 DNA 到95oC 进行变性（denature） 使双链解离为单链，解除变性条件后在较低的温度50oC下引物退火（annealed）结合到目标序列上，然后在72oC下， 在dNTPs存在的情况下， DNA 聚合酶运用使引物序列延伸（ extends ） 。热稳定的酶不仅可以使DNA快速合成, 而且在较宽的温度范围内都能催化DNA合成。 三个步骤：变性, 退火 和 延伸 PCR循环: 一般 25-40 个循环. 每个循环都使目标序列翻倍从而PCR可以快速扩增 Polymerase Chain Reaction（PCR） PCR 扩增过程中片段增殖的计算 随着扩增循环数的增加，长链目标片段增加的值为 2(n+1), 而短链目标片段则以几何倍数增加值为 2(n+1) – 2(n+1)。 20个循环后, 目标片段大约增加 1 百万倍。 PCR 使用的引物需特异性与目标序列匹配， 如果引物与DNA分子的其他部位结合, 非特异扩增将产生。 引物与目标序列的特异性结合取决于温度, 每对引物最适的温度要通过实验获得。 寡核苷酸引物的长度一般为 20-25 个碱基，GC 含量一般为 50% 左右，这样退火温度在52-58oC之间。很长的寡核苷酸引物或高的GC含量 需要很高的温度，而短的寡核苷酸引物或低的GC含量则需要较低的温度。对于 17-25 个碱基的引物, Tm的计算为: 最适的退火温度一般比 Tm低3-5oC。 Primer design and cycle optimization 1、所设计引物长度范围为18-27碱基，最长不超过38，因为过长会导致延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。 2、引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则会容易导致错配。引物3端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发率增加。引物退火温度在50-70℃之间，上下引物之间退火温度相差不超过5℃。 3、GC含量在40-60%之间，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 4、3末端最好不是A，3末端为A的错配效率明显高于其它三个碱基。 引物设计原则 PCR反应体系的确立 Water Buffer（10×） Mg++（25mM） dNTPs（10mM） Primer1（10uM） Primer2（10uM） Taq（5U/uL） Templets 12.8 2 1.6 0.4 1 1 0.2 1 128 20 16 4 10 10 2 … 20uL反应体系中各成分的母液浓度及加入量 PCR扩增程序举例 Tem. 94℃ 94℃ 56℃ 72℃ 72℃ Time 00:08:00 00:00:30 00:00:40 00:01:00 00:07:00 Cycles ―― 35 ―― PCR反应的应用 广泛应用于科研和实际检测中，用于DNA 研究、序列分析、基因表达测定、从cDNA库放大特定克隆、构建基因图、进化分析、生物证据分析、医学研究与临床检验、性别控制、转基因生物检测等。 PCR扩增结果分析举例 M 1 2 3 4 5 6 7 M M, marker;1-2, PCR for CP4-EPSPS gene; 3-4, PCR for 35S Promoter; 5-6, PCR for lectin gene; 7, Negtive control. 思考题：