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常用实验基本技术（续） 山东大学医学院组胚教研室 史玮 四大常用基本技术 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR） 免疫组织化学技术（免疫组化） 免疫印迹技术（Western blot） 细胞培养技术 局限性 联合应用 细胞培养技术 细胞培养（Cell culture）是指从生物体内取出组织或细胞，在体外适当的条件下，使之存活、生长和繁殖，并维持其结构和功能的方法。 细胞培养便于应用各种方法和技术进行研究，并可直接观察，已成为现代生物医学研究中一项非常重要的技术。 培养细胞的生存条件 无菌环境（器皿、超净台） 超纯水 温度（37℃左右） 气体（5%CO2/空气） PH值（7.0-7.4，细胞耐酸不耐碱） 营养条件（基础培养基+10%FBS） 渗透压、培养基质等 细胞培养用液 平衡盐溶液：洗涤组织、细胞 D-Hanks液、PBS液等。 消化液：分散细胞 0.25%胰酶、0.02%EDTA液或二者混合使用 培养液：细胞生存、生长和繁殖 基础培养基(DMEM、RPMI1640等），已商品化 10%左右的胎牛血清（FBS） 培养细胞的来源 直接取材： 实验动物、胚胎、临床标本等 细胞系： 各实验室保存 细胞库：上海中科院细胞库、武汉细胞库、 中国医科院细胞中心 培养方式 原代培养： 直接从生物体内获取组织细胞进行的首次培养。 只能原代培养：神经元、心肌细胞等。 传代培养： 当培养细胞增殖到一定密度后，生长受到抑制， 需要分散稀释后重新培养。 常见：肿瘤细胞系 培养细胞的处理 改变细胞外部因素 改变细胞内部因素 外部因素 药物 高温 低氧 射线 … 内部因素 改变细胞内基因表达水平： 上调：基因转染 下调：RNAi 细胞转染 转染（transfection）是指将外源性DNA或 RNA导入细胞的过程。 上调目的基因表达： 质粒载体 病毒载体 下调目的基因表达： 化学合成siRNA 质粒载体 病毒载体 转染方法 电转法 脂质体介导的转染法 病毒载体介导的转染法 … 转染试剂 脂质体与非脂质体：商品化，多家公司如Invitrogen、Fermentas、Qiagen等都有售。 常用： Invitrogen公司Lipofectamine 2000 可用来转染质粒和siRNA. 其他专用试剂：如Invitrogen公司RNAiMAX Transfection Reagent 专门用来转染siRNA. 瞬时转染与稳定转染 瞬时转染：将DNA导入活细胞内，但DNA不会嵌入细胞的染色体中，可在2-3天内收集被转染的细胞进行基因表达分析。 稳定转染：将目的基因导入活细胞，根据选择标记经过一段时间的筛选，使目的基因整合入细胞染色体中，从而得到稳定表达目的基因的细胞系。 真核筛选标记 设立对照组 空载体对照：如PCDNA3、PEGFP-N1等。 Scrambled siRNA：将选中的siRNA序列打乱。作为阴性对照的scrambled siRNA应该与选中的siRNA序列有相同的核苷酸组成，并且与目的基因的mRNA没有明显的同源性。 细胞特性检测 活力：MTT实验 凋亡：TUNEL染色、流式细胞术等 增殖：BrdU掺入法、克隆形成实验 分化：形态学观察、分化标志物检测 致瘤性：体内成瘤实验 … 靶基因表达水平检测 RT-PCR Western blot 免疫组化 其他：基因芯片、流式细胞术等 细胞培养的应用 用途： 1.验证体内实验结果 2.进行深入机制研究 优点：可同时获得大量生物学性质相似的细胞作为研究对象，便于施加各种干预因素，方便观察与检测。 局限性：不能准确反应体内的真实状况，需与体内实验相互验证。 神经干细胞分离培养 取E12.5d小鼠胚胎端脑，制成单细胞悬液，接种于神经干细胞培养基，体外培养2天，可见神经球形成。 NSC鉴定 体外培养神经干细胞BrdU(+)，Nestin(+)，并能分化为MAP2 (+)神经元和GFAP (+)星形胶质细胞。 出生后7天小鼠脑切片，可见G-CSFR与Nestin共表达。SVZ：室管膜下区；LV：侧脑室 体外培养神经干细胞，免疫染色结果显示：Nestin（神经干细胞marker）与G-CSFR共表达于神经干细胞。RT