基因重组技术优化红霉素发酵菌的研究-食品科学专业论文.docxVIP

沈阳农业丈学博士学位论文摘 沈阳农业丈学博士学位论文 摘 要 红霉素发酵生产属于好氧发酵，需要充足的氧气供应。由于氧在水中的 溶解度较低，距离微生物正常生长的需氧量相距甚远，而供氧不足会导致菌 体生长不良和红霉素产量的下降。要提高红霉素的产量必须提供足够的氧气， 但这将提高红霉素的生产成本。 透明颤菌血红蛋白(VHb)是迄今为止发现的唯一一种原核生物血红蛋白， 它与真核生物的血红蛋白具有较高的同源性，在贫氧条件下能够促进细胞旧 生长和蛋白质的合成。利用VHb在糖多孢红霉菌中表达透明颧菌血红蛋白基 因(vgb)，解决红霉素发酵生产中的供氧问题，将对工业生产产生巨大的科学 意义，并可能带来巨大的经济效益。 本文的研究从透明颤菌的筛选入手，并对其进行了生理和生化测试。测 定结果显示：目标菌中血红素的含量非一般细菌可比，就目前所知，这种菌 只能是透明颤菌。对透明颤菌培养条件的研究结果显示，在含有蛋白胨O．30A．， 酵母粉0．7％，NaAc 0．02％，pH 7．8的培养基中150rpm，34(2培养时生长最好。 根据vgb的核酸序列设计引物，扩增出vgb基因，并与质粒pQE-30连接， 构建载体pQE V，将其转入大肠杆菌中，并通过SDS．PAGE和Western blotting 分析证明vgb基因在大肠杆菌中得到了克隆和表达。对转入大肠杆菌的pQE V 中的DNA序列进行测序，将测序结果与已发表的vgb基因序列进行比较，同 源性为97％，证明是，啦基因。 根据报道的核酸序列设计引物，分别通过PCR反应扩增PmerR启动子和 糖多孢红霉菌染色体上的两段DNA片段，与之前扩增的vgb以及从质粒 pBll01中酶切获得的GUS基因共五段碱基序列，首先在体外连接成片段3， 然后再与载体pBluescript SK经T4连接酶连接，得到构建的载体pBlueV。 对pBlueV进行j◇”I和BstX I双酶切，将含有y庐的一段通过电穿孔转 化法转入糖多孢红霉菌中。提取糖多孢红霉菌转化菌株的基因组DNA，经 Mst I和Bgl I酶切消化，以扩增的片段1为探针，进行Southern blotting检测， 实验结果证明，啦基因已经整合到了糖多孢红霉菌的染色体中。Westem blotting分析进一步证明，重组菌株能够合成血红蛋白。 本文就vgb基因表达对糖多孢红霉菌发酵产量的影响进行了研究。对转化 前后糖多孢红霉菌的原始菌株和重组菌株进行补料分批培养，培养结果显示： 重缀菌株与原始菌株相比，总蛋白浓度约低27％，红霉素体积产率提高29％， 这说明重组菌株的比代谢活性得到了显著提高。对重组菌株和原始菌株的发 摘要的发酵液进行Western 摘要 的发酵液进行Western blotting分析，前者在整个发酵过程中的所有发酵液中 均检出了与阳性对照相对应的清晰VHb谱带，而后者中未能检出。 本文利用基因重组技术优化红霉素发酵菌株，对于红霉素的发酵生产具 有重大的意义。 关键词：质粒；电穿孔转化；糖多孢红霉菌；血红蛋白：vgb 沈阳农业大学博士学位论文刖 沈阳农业大学博士学位论文 刖 吾 抗生素发酵生产需要充足的氧气供应，由于氧在水中的溶解度较低，距 离微生物正常生长的需氧量相距甚远，而供氧不足会导致菌体生长不良和抗 生素产量的下降。因此，溶氧问题成为抗生素发酵生产的重大问题。 红霉素是由糖多孢红霉菌产生的一类大环内酯类抗生素，在临床上广泛 用于治疗由原核病原体如链球菌、葡萄球菌、支原体、衣原体等引起的感染， 目前每年的需求量都在不断增加。这就要求我们提高红霉素的产量。红霉素 发酵生产属于好氧发酵，要提高红霉素的产量必须提供足够的氧气。目前， 通常采用提高搅拌速度和增加通气量等方法来解决氧气不足的问题，但这往 往对设备的要求较高，需要消耗大量的能量，从而增加生产成本。 尽管研究者利用经典的菌株改良方法如诱变和筛选等对其进行了改良． 但发酵获得红霉素的最终效价与其它几种二次代谢物(如青霉素)相比仍然 很低。既然用经典的菌株改良方法无法提高红霉素的产量，人们开始将基因 工程等新的研究手段应用于这方面的研究。 然而任何新的方法必须考虑到菌体进行大规模发酵培养时所处的特殊 生长条件。菌体培养过程中处在粘稠、营养丰富、复杂的环境中，在这种条 件下，对数生长期的块状菌丝体所需的氧气可能会受到限制，从而使红霉索 的产量减少。在大规模的生物反应器中提高氧气的利用率是解决这一问题的 有效途径，然而通过提高气液转移率却无法改善块状菌丝体形成过程中氧气 受限的问题。因此，我们试图找到一种能够有效提高细胞利用氧气能力的方 法，从而降低氧能耗，提高红霉素的产量。 透明颤菌血红蛋白(VHb)是迄今为止发现的唯一一种原核生物血红蛋 白。它与真核生物的血红蛋白具有较高的同源