实验九质粒dn到a的制备.pptVIP

实验四 碱变性法小量制备质粒DNA 一．实验目的及背景 质粒是染色体外的DNA分子，大小可为1kb到200kb。 大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在。 其复制和遗传独立于细菌染色体。 质粒类型 质粒按复制方式分为两种类型： 1.松弛型质粒 松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白。即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制依然进行。当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素等抗生素存在时，质粒的拷贝数可达 2000-3000 拷贝。 2.严紧型质粒 严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白，质粒的拷贝数不能通过用氯霉素等蛋白合成抑制剂来增加。 质粒的应用 大多数基因工程使用松弛型质粒。 严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的基因。 质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。 分离质粒DNA方法 从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的 碱变性法； 煮沸法； SDS法； 羟基磷灰石层析法等 各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切,连接与转化。 本实验目的 本实验要求掌握最常用的质粒的提取方法。 碱变性法基本原理 在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。 将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 试剂 溶液Ⅰ： 25mM Tris·HCl（pH8.0） 10mM EDTA 溶液Ⅱ：（新鲜配制） 0.2N NaOH 1% SDS 溶液Ⅲ： 5M KAC 10ml 冰醋酸 11.5ml 水 28.5ml (酚/氯仿)，异丙醇, 乙醇 RNase 琼脂糖 ＴＥ： 10mM Tris-HCl(pH8.0) 1mM EDTA pUC19  链长2,686 bp 多克隆位点：EcoR I, Sac I, Kpn I, Sma I, BamH I, Xba I, Sal I, Pst I, Sph I 和Hind III 只有一个酶切位点。 用途 克隆外源基因。 利用lac promoter进行基因表达。 使用M13 primers进行DNA测序。 三．实验方法 1. 挑单克隆E.coli菌株接种到培养基上（活化菌种），37℃过夜培养 2. 从培养基上挑E.coli菌株，接种于25毫升液体培养液内（含氨苄），37℃振荡过夜培养 3. 从中取4毫升种子菌液于LB培养基中（含Amp），37℃振荡培养3-4小时 一 细菌培养与质粒扩增 二 质粒提取 1. 取1ml培养物倒入 Eppendorf 管中，4000-5000r/min，5min 2. 吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥 3. 将细菌沉淀悬浮于150μl溶液Ⅰ中，振荡混匀。 4. 加入150μl溶液Ⅱ，盖严管盖轻柔颠倒５次以混匀内容物，室温放置5分钟。 5. 立即加入150μl溶液Ⅲ，温和振荡数次，冰上放置５分钟。 6. 12000r 4 ℃离心10分钟，取上清移到１个新的Eppendorf管中。 7．加入等体积异丙醇，振荡混匀，于室温静置5分钟,12000r 4 ℃离心15分钟。 8．弃上清，加入１ml 70%乙醇漂洗沉淀，盖严管盖颠倒数次，8000r 于离心5分钟。 9．弃上清，抽干乙醇，室温干燥（5-15分钟）。 10．加入20μl TE（含20μg/ml RNA 酶，不含DNA酶）溶解DNA。 问题与讨论： １．简要叙述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作用，以及实验中 分别加入上述溶液后，反应体系出现的现象及其成因。 ２．染色体DNA与质粒DNA分离的主要依据是什么？ 3. 沉淀ＤＮＡ时为什么要用无水乙醇及在高盐、低温条件下进行？