基因工程控制植物育性的基因表达调控和蛋白质工程研究-分子生物学专业论文.docxVIP

摘 摘 要 Barnase是一种活性很强的核糖核酸酶基因，早在80年代国际上就有利 用该基因在肿瘤细胞中特异表达，造成肿瘤细胞的坏死，从而达到肿瘤治疗 的目的。后来，植物学家将这一策略运用到植物育性的控制表达上，于1990 年利用花药特异表达启动子表达核糖核酸酶基因(garnase)转化烟草获得首 例人工转基因雄性不育烟草，后又于1992年利用Barnase和garstar基因获 得了转基因雄性不育油菜及其恢复系，自此国内外一些实验室也先后在此方 面进行了研究。随着作物育性基因工程研究的深入，Martine等(1993)发现 在实践中被广泛应用的由烟草花药特异启动子TA29和RNase T L形成的嵌合 基因的表达易受环境温度的影响，李胜国等(1997)的研究也表明由 TA29—8aFNase形成的嵌合基因获得的转基因烟草也存在高温不稳定表达的问 题。 通过对文献的综合研究，我们发现了目前这一领域还存在的一些问题： (1)肩动子的活性影响着目的基因的高效和稳定表达；(2)转基因雄性不育植 株的不育性状在后代的遗传中稳定性较差；(3)转基因作物的转化率较低，锻 阳性较高，加大了对转基因后代进行大规模遗传操作的无义性。我们的工作 就是在此基础上有针对性地设计了几个实验方案，以期能为基因工程控制植 物育性的研究做一些基础性探索。 针对第一个问题，我们从拟南芥菜(Arabidopsis thai iana)WS生态型中Pc 扩增得到”截短”的0．78kb的A6和0．3kb的A9基因5’旁侧区DNA片段。序j 分析表明，与文献报道的同源性分别达到了99．g％和99，7％。将两旁侧区片段j 别与细胞毒素基因(Barnase)融合，导入含有抗溴苯腈(Bxn)基因的植物双元i 达载体构建成pWPA6N和pWPA9N，并经农杆菌LBA4404介导获得转基因植株， Southern杂交等鉴定均证明目的基因己整合进烟草基因组。另经与～个烟草} 药发育早期的特异启动子TA29的配合使用，改造了两个植物雄性不育基因自辑 性不育性状，如花丝变短、花药瘦小等，说明改造后的启动子调控区在烟草花 性不育性状，如花丝变短、花药瘦小等，说明改造后的启动子调控区在烟草花 药的绒毡层中定位启动了雄性不育基因Barnase的表达，截断了对花粉母细胞 的营养供给，造成小孢子发育不良，从而引起花粉败育。另经高温敏感性测试 四种表达载体均可见育性恢复现象，说明由启动子活性造成转基因雄性不育植 株高温不稳定性的可能性不大，为进一步研究不同启动子及启动子活性对雄性 不育嵌合基因表达的影响开辟了新思路。 针对第二个问题，我们从陆地棉“中抗17号”中分离了花粉特异表达基 因G9转译起始点上游567bp的基因调控区，将其分别与葡糖醛酸酶基因(Gus) 和细胞毒素基因(Barnase)融合构建了用于遗传转化的植物表达载体，经基因 枪介导的Gus基因瞬时表达表明GUS在棉花花粉中的表达分别是对照叶片的 7倍、对照花粉的5倍，首次证明了G9转录起始点上游序列具有启动外源基 因在花粉中定位高效表达的生物活性；设计的隐性核雄性不育的实验策略， 是通过农杆菌介导法将G9一Barnase基因转入烟草基因组中，使其在花粉中得 到了定位表达，获得了隐性核雄性不育的转基因植株，并利用该结果欲获得 基因工程雄性不育保持系植株。 针对第三个问题，为增强转基因植株筛选的可靠性，避免后期遗传水平 的无效操作，我们回避了重复性差的棉花DNA水平的检测，我们克隆并表达 了核糖核酸酶抑制蛋白Barstar，在获得了高表达量的Barstar目的蛋白的基 础上，经亲合层析纯化后进行了动物免疫实验，得到了Barstar目的蛋白的 多克隆抗体；利用获得的抗体对农杆菌介导获得的转基因棉花的恢复系、不 育系植株进行了蛋白质水平的分子检测，结果发现制备的Barstar抗体不但 可与转基因植株中的基因表达产物Barstar特异性结合，而且还可与Barnase 蛋白免疫性结合，初步证明了蛋白水平的分子检测在转基因棉花筛选和分析 中的应用价值。 *律词．纳胸寰素甚冈．甚|夭l嘉沃调棒．麟曼寓劫罕．降壮掳不畜群白嘉 AbstractHybrid Abstract Hybrid varieties of crop plants are grown when the increased productivity gained from heterosis offsets the extra cost of their development and seed production One important factor in economically visble hybrid seed production is the availab