重组体的筛手选与鉴定.ppt

第六章 重组体的筛选与鉴定 转化子：在DNA分子克隆中，通常将导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子； 重组子：含有重组DNA分子的转化子； 期望重组子（目的重组子）：含有外源目的基因的重组子。 *为什么要进行筛选和鉴定？ （1）不带任何外源DNA插入片段，仅由线形载体分子自身连接形成的环状分子； （2）由一个载体分子和数个外源DNA片段组成的重组分子； （3）单纯由数个外源DNA片段连接而成的多聚DNA分子； *鉴定的方法有哪些？ 载体表型选择法 根据插入序列的表型特征选择 DNA电泳检测法 核酸杂交检测法 免疫化学检测法 转译筛选法 第一节、载体表型选择法 根据载体所携带的标记基因的表型进行选择。 一、抗药性标记插入失活选择法 二、?-半乳糖苷酶显色反应选择法 一、抗药性标记插入失活选择法 插入效应:外源DNA片段与载体特定部位连接后，使载体的相关功能发生改变，为重组子的筛选提供信息。 插入失活 插入表达 抗药性插入失活指的是外源DNA插入载体的抗药性筛选标记中，导致该基因结构破坏而失活，使细胞丧失对抗生素抗性的功能。 在LacZ体系中，两个彼此互补的突变基因各自编码产生的多肽产物均无活性，但两个突变体间通过α肽互补作用可呈现有功能的β-半乳糖苷酶活性，进而可分解底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）而产生深蓝色物质，使菌落呈现蓝色。 当外源基因DNA片段插入载体中LacZ’ α肽区段的多克隆位点后，会阻断α序列的读码结构，使其编码的α肽失去活性，使重组子所在的细菌不能完成α-互补而形成白色菌落。根据这种β-半乳糖苷酶的显色反应，可以检测和筛选出携有外源基因重组子克隆。此法又称蓝白筛选法。 第二节、根据插入序列的表型特征选择 根据克隆片段为寄主提供的新的表 型特征选择重组体DNA分子 例如：亮氨酸（Leu)缺陷菌在无Leu培养基中不生长,当含Leu外源基因在此缺陷菌中表达时可生长，以此来筛选阳性克隆。 *局限性： 克隆的DNA片断是一个完整的基因序列 能在原核生物中实现功能表达 第三节、DNA电泳检测法 一、直接电泳检测法 二、酶切电泳筛选法 三、PCR扩增检测法 一、直接电泳检测法 菌落 提取质粒 单酶切 电泳 适于插入片段较大的重组子初筛 二、酶切电泳筛选法 经初筛鉴定有重组子的菌落，小量培养后，再分离出重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的内切酶切割，释放出插入片断。 三、PCR扩增检测法 利用外源DNA插入位点两侧存在的特定序列设计引物，对外源DNA进行PCR分析。 第四节、核酸杂交检测法 一、原理 具有一定同源性的两条核酸单链（DNA或RNA）在适宜的温度和离子强度等条件下，可按碱基互补配对原则高度特异的复性形成双链。 二、核酸杂交检测方法 1.核酸探针 概念：核酸探针是指带有标记的与目 的基因同源互补的一段核苷酸序列。 大小：长度以50-300个碱基为宜 种类：DNA探针、CDNA探针、RNA探针 2.探针标记物 ㈠ 放射性标记物 常用的有32P、35S; ㈡ 非放射性标记物 常用的有生物素、地高辛和荧光素等。 3.核酸杂交方法 液相杂交 固相杂交 4．杂交膜的选用 硝酸纤维素膜:本底浅，与小片段核酸(200bp)结合不牢，质地脆，不易操作； 尼龙膜:韧性好，耐用，结合力强，可与小至10 bp的片段共价结合。 5.固相核酸杂交的主要过程： 1）核酸的变性； 2）变性核酸在膜上的固定； 3）预杂交； 4）杂交； 5）洗膜； 6）结果显示。 1）菌落杂交或噬菌体杂交 把生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑按照其原来的位置不变地转移到滤膜上，在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用，以从成千上万的菌落或噬菌斑中鉴定出含有重组体分子的菌落或噬菌斑的方法。 *适于从基因文库中筛选目的基因 2）Southern杂交 提取总DNA 酶切 琼脂糖凝胶电泳 碱变性 转膜 固定 杂交 3） Northern印迹杂交 (Northern blot hybridization)： *不能采用碱变性法。 *常采用甲醛、聚乙二醛、二甲基亚砜、甲基氢氧化汞等变性方法。 4.斑点杂交(dot hybridization)： 直接将变性DNA样品点于硝酸纤维素膜上，固定好后再进行杂交。 （1）DNA斑点杂交 （2）RNA斑点杂交 （3）完整细胞斑点杂交 第五节、免疫化学检测法 一、放射性抗体检测法 二、免疫沉淀检测法 三、酶联免疫吸