基因转染rp105抑制tlr4对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护及机制分析-免疫学专业论文.docxVIP

三峡大学硕士学位论文 三 峡 大 学 硕 士 学 位 论 文 内 容 摘 要 目的：本项目通过构建携带 RP105 基因的复制缺陷型重组腺病毒载体，间接冠 脉在体转染大鼠心肌，使 RP105 在心肌组织高表达，在大鼠在体心脏缺血再灌注模 型中，以 TLR-4 信号通路为切入点，从基因表达、蛋白合成等多个层次研究 RP105 对心肌缺血再灌注损伤的保护作用，探讨其分子机制。 方法： SPF级雄性SD大鼠40只，随机分为4组(n=10)：生理盐水+假手术组(Sham 组，只穿线不结扎)、生理盐水+缺血再灌注组(I/R组）、Ad-RP105+ 缺血再灌注组(Ad-R 组)、Ad-GFP+缺血再灌注组(Ad-G组)。重组腺病毒间接冠状动脉转染大鼠心肌，3d 后建立心肌缺血再灌注模型。术后2h空气栓塞法处死大鼠，采用光镜观察心肌组织的 病理形态学改变；Evans blue和TTC双染法估测心肌梗死面积；酶联免疫吸附试验 (ELISA)测定心肌TNF-α和IL-6的含量；Real-time PCR和Western blot检测心肌RP105、 TLR-4、MyD88、 NF-κB mRNA水平和蛋白表达情况。 结果：(1)采用携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒(Ad-GFP)成功转染大鼠在体 心肌，结果显示，大鼠生存状态良好，心肌转染效率达91.5%。(2)光镜结果显示，Sham 组心肌超微结构及组织形态正常；IR组与Ad-G组心肌损害严重，而经目的基因RP105 处理过的Ad-R组心肌变性坏死得到显著改善。(3)与IR组相比，Ad-R组心肌梗死面积 明显减少(41.3±1.5% vs 26.7±1.3% , P0.05)，差异有统计学意义；G组心肌梗死面 积(39.9±1.2% )变化并无统计学意义。(4) 与Sham组相比，Ad-R组RP105 mRNA及蛋 白表达均显著增加(4.080 vs 1, 0.374 vs 0.149, P0.05)，而在I/R组与Ad-G组，其表达 明显下调，P 0.05，差异有统计学意义。(5)与Sham组比较，缺血再灌注后各组心肌 组织中TLR-4、MyD88、NF-κB mRNA及蛋白表达均增加，其中I/R组与Ad-G组显著 升高，差异有统计学意义；与缺血再灌注组IR组比较，Ad-R组显著降低，差异有统 计学意义。(6)构建缺血再灌注损伤模型后，心肌组织中TNF-α和IL-6表达水平升高， IR组与Ad-G组较Sham组显著上升(P0.05)；与IR组相比，Ad-R组心肌组织中TNF-α 和IL-6表达水平受到一定抑制(P0.05)，差异有统计学意义。 结论：(1) 复制缺陷型腺病毒对于大鼠生理功能并无明显影响，安全有效；(2) 构 建携带有目的基因RP105的复制缺陷型病毒，进行大鼠在体心肌转染，可显著提高心 肌组织中RP105mRNA及蛋白表达； (3) 心肌细胞RP105高表达，可显著减轻心肌缺 血再灌注损伤；(4)TLR-4信号通路在大鼠心肌缺血再灌注损伤过程中被激活，心肌组 织TLR-4、MyD88、NF-κB基因及蛋白表达水平显著升高，并分泌TNF-α和IL-6炎性 因子介导炎症级联反应，参与缺血再灌注损伤发生的病理生理过程；(5) RP105可能 通过抑制TLR-4介导的信号转导通路，减少下游炎症因子的产生，对大鼠心肌缺血再 II 灌注损伤发挥保护作用。 关键词：RP105 基因转染 缺血再灌注损伤 TLR-4/NF-κB III Abstract Objective To construct and identify the recombinant Ad-RP105 vector, which made the high expression of RP105 gene in ischemia-reperfusion myocardium.To observe the effects of RP105 gene on myocardial after transfection of adenovirus-mediated RP105 vector in the ischemia-reperfusion injury rats models. We investigate the protection and mechanism of RP105 gene on myocardial ischemia-reperfusion from levels of gene expression and protein synthesis through TLR-4 signaling pathway, which supply a new approach to ischemia-reperf