esat6-音cfp10载体构建.ppt

1 ESAT6、CFP10基因引物设计 ESAT6基因引物（Oligo6.0软件设计，引物设计演示） Upper Primer: 5 GGA ATT CCA TAT GAC AGA GCA GCA GTG 3 Lower Primer: 5 GGG GTA CCT GCG AAC ATC CCA GTG ACG TT 3 ATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAGGCCGCGGCAAGCGCAATCCAGGGAAATGTCACGTCCATTCATTCCCTCCTTGACGAGGGGAAGCAGTCCCTGACCAAGCTCGCAGCGGCCTGGGGCGGTAGCGGTTCGGAGGCGTACCAGGGTGTCCAGCAAAAATGGGACGCCACGGCTACCGAGCTGAACAACGCGCTGCAGAACCTGGCGCGGACGATCAGCGAAGCCGGTCAGGCAATGGCTTCGACCGAAGGCAACGTCACTGGGATGTTCGCATAG 引物设计原则 1 引物长度一般在15~30碱基之间 　　引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。 2 引物GC含量在40%~60%间，Tm值最好近72℃ 　　GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 3 引物3′端不能选择A，最好选择T。(引物3′端错配 ) 4 引物自身及引物之间不应存在互补序列。(发夹结构、二聚体) 5 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰 6 5′ 端和中间G值应相对较高3′ 端较低 CFP10基因序列引物 Upper Primer: 5 GGG GTA CCG CAG AGA TGA AGA CCG AT 3 Lower Primer: 5 GGA ATT CTC AGA AGC CCA TTT GCG AG 3‘ 保护碱基表.doc ATGGCAGAGATGAAGACCGATGCCGCTACCCTCGCGCAGGAGGCAGGTAATTTCGAGCGGATCTCCGGCGACCTGAAAACCCAGATCGACCAGGTGGAGTCGACGGCAGGTTCGTTGCAGGGCCAGTGGCGCGGCGCGGCGGGGACGGCCGCCCAGGCCGCGGTGGTGCGCTTCCAAGAAGCAGCCAATAAGCAGAAGCAGGAACTCGACGAGATCTCGACGAATATTCGTCAGGCCGGCGTCCAATACTCGAGGGCCGACGAGGAGCAGCAGCAGGCGCTGTCCTCGCAAATGGGCTTCTGA 2 ESAT6、CFP10目的基因PCR扩增 PCR扩增 PCR扩增目的基因.ppt 反应体系 (ESAT6基因) 反应体系单位 （μl） ddH2O 30.0 10×buffer 5.0 dNTP 4.0 P1引物 4.0 P2引物 4.0 模板DNA 2.5 DNA聚合酶 0.5 总体积 50 PCR扩增条件(ESAT6基因) 96℃ 预变性3 min ； 96℃ 变性45 sec、 62℃退火45 sec、 72℃延伸1 min， 共30次循环 ； 72℃延伸7 min。 电泳 1%-2%琼脂糖凝胶电泳 基因DNA纯化回收（凝胶回收试剂盒）