酶的提取与分离纯化.pptVIP

第六章 酶的提取和分离纯化 定义：酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。 原则：酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。 酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。 提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、缩短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。 为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。 ■ 酸溶液提取 有些酶在酸性条件下溶解度较大，且稳定性较好，易用酸溶液提取。 注意事项： pH值不能过低，以免使酶变性失活。 ■ 碱溶液提取 有些酶在碱性条件下溶解度较大，且稳定性较好，应采用碱溶液提取。 注意事项： pH值不能过高，以免使酶变性失活。 ■ 有机溶液提取 有些酶与脂质物质结合牢固，或含有较多的非极性集团，可以采用与水可以混溶的乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂提取。 注意事项： pH值不能过低，以免使酶变性失活。 影响酶提取的主要因素 ☆温度 在适当的范围内，提高温度可以加快酶的提取； ☆pH 避免在等电点； ☆提取液的体积 增加提取液的用量，可以提高酶的提取率；但是过量的提取液，会使酶的浓度降低，对进一步分离纯化不利 第四节 酶的分离方法 沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，目前仍广泛应用在工业上和实验室中。 由于其浓缩作用常大于纯化作用，因而沉淀法通常作为初步分离的一种方法，用于从去除了菌体或细胞碎片的发酵液中沉淀出生物物质，然后再利用色层分离等方法进一步提高其纯度。 沉淀法由于成本低、收率高(不会使蛋白质等大分子失活)、浓缩倍数高可达l0-50倍和操作简单等优点，是下游加工过程中应用广泛的值得注意的方法。 2、 沉淀的种类 盐析沉淀法 等电点沉淀法 有机溶剂沉淀 热沉淀法 复合沉淀法 选择性变性沉淀法 1、盐析沉淀法 （一）定义：是利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离的过程。 （二）原理 1.高浓度盐离子使蛋白质表面双电层厚度降低，静电排斥作用减弱. 2.中性盐比蛋白质具更强的亲水性，因此将与蛋白质争夺水分子. 蛋白质表面特性 蛋白质溶解：相似者相溶 亲水性和疏水性： 有利因素：亲水性，包括氢键、极性基团、离子化侧链、亲水蛋白所占的%等。如白蛋白 不利因素：疏水性，包括暴露的疏水基团、疏水蛋白所占的%等。如纤维蛋白原。 盐析的基本原理图 三、盐析剂中性盐的选择 盐析常用的中性盐：硫酸铵最常用。 其优点是：溶解度大，25℃时饱和溶解度为4.1mol/L，即767g/L; 0℃时饱和溶解度为3.9mol/L,即676g/L，在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以析出来；分段效果比其它盐好，不容易引起其它蛋白质变性；价廉易得。 四、盐析剂用量的确定 例：以硫酸铵盐析糖化酶 五、分部盐析法 1.分部盐析法 2.盐析曲线 3.两种酶的分离 六. 盐析的影响因素 1.蛋白质的种类 蛋白质的种类不同，Ks（盐析系数）值会有所不同； 分子量越大，沉淀所需盐的量越少； 2. 蛋白质的初始浓度 不同浓度的蛋白质溶液产生沉淀所要求的临界盐浓度不同。 蛋白质浓度大时，中性盐的极限沉淀浓度低，共沉作用强，分辨率低，但用盐量减少、蛋白质的溶解损失小。 相反，蛋白质浓度低时，中性盐的极限沉淀浓度高，共沉作用小，分辨率高，但用盐量增大、蛋白质的回收率低。 3.无机盐种类 阴离子盐析作用顺序 柠檬酸盐PO43－SO42－CH3COO－Cl－ NO3－SCN－ 阳离子盐析作用顺序（一价） NH4+K+Na＋ 4.温度 在高离子强度溶液中，升高温度有利于蛋白质的失水，使之溶解度下降。 在低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定温度范围内一般随温度升高而增大。 5.pH值 在接近蛋白质等电点的溶液中进行盐析有利于蛋白质的沉淀。需要注意在高盐溶液中蛋白质的等电点会发生偏移。 2、等电点沉淀法 等电点定义； 在等电点时溶液的性质； 3.有机溶剂沉淀法 蛋白质和酶的水溶液，在逐渐加入乙醇、丙酮等有机溶剂后，其溶解度可不同程度地显著降低，从溶液中沉淀