华贵栉孔扇贝卵黄蛋白原基因克隆表达及其免疫功能的初步研究-海洋生物学专业论文.docxVIP

汕头大学硕士学位论文 华贵栉孔扇贝卵黄蛋白原基因克隆表达及其免疫功能的初步研究 Primary Studies on Cloning, Expression and Immune Function of Vitellogenin Gene in Noble Scallop Chlamys nobilis 学 位 申 请 人：张 倩 导 师：郑怀平 （教授，博导） 专 业：海洋生物学 答辩委员会主席： 答辩委员会委员： 汕头大学海洋生物研究所 中国，汕头，515063 摘要 摘要 摘要 华贵栉孔扇贝(Chlamys nobilis)以其贝壳具有橙色、橙紫色、紫色、褐色等多种绚丽的 色彩而闻名。因其营养丰富、味道鲜美、生长快、养殖周期短、经济效益高，自上世纪 70 年代就已经成为我国南方重要的海水养殖贝类。 卵黄蛋白原(Vitellogenin, Vg)作为卵黄蛋白(Yolk protein, Vn)的前体，广泛存在于卵生 非哺乳类性成熟动物中，在卵子和胚胎的发育过程中具有重要的作用，不仅能为发育中的 动物胚胎提供氨基酸、脂肪、碳水化合物等营养物质，还能转运类胡萝卜素、维生素等功 能性物质，此外，还在生物体内参与免疫防御过程，具有免疫功能。 本文以华贵栉孔扇贝橙色和褐色个体为材料，首次克隆了 Vg 基因的全长 cDNA，并 进行了同源性分析、时空表达分析及其与类胡萝卜素含量、总抗氧化能力的关系的研究， 初步分析 Vg 基因免疫相关功能及其作用机理。主要结果如下： 1、Vg 基因全长 cDNA 序列的克隆。采用同源克隆结合 RACE-PCR 的方法，首次克 隆得到华贵栉孔扇 Vg 基因的全长 cDNA 序列，全长 7760 bp，共编码 2289 个氨基酸残基。 取 21 个 物 种 做 同 源 分析 发 现 ， 栉 孔扇 贝 (Chlamys farreri) 和虾夷扇贝 (Mizuhopecten yessoensis)显示出更近的亲缘关系，先汇成一支后与华贵栉孔扇贝汇聚，之后依次与其它 海洋贝类、昆虫、虾、蟹等节肢动物聚类，最后与脊椎动物类聚。 2、Vg mRNA 时空表达分布。采用荧光定量 PCR 技术检测 Vg mRNA 在不同组织不 同发育时期的表达水平变化，结果显示，Vg mRNA 具有组织表达特异性和性腺发育水平 相关性。Vg mRN A 在卵巢中大量表达，在精巢及其他组织中只有痕量表达；Vg mRNA 在 生长期表达水平较高，在成熟期显著下降，在排卵后期又恢复到较高水平。 3、Vg 与类胡萝卜素含量、总抗氧化能力的关系。通过对卵巢 Vg mRNA 表达水平、 类胡萝卜素含量及总抗氧化能力的测定，发现 Vg mRNA 表达水平与类胡萝卜素含量，Vg mRN A 表达水平与总抗氧化能力、类胡萝卜素含量与总抗氧化能力之间存在显著的(P 0.05)正相关性。 4、Vg mRNA 在感染实验中的变化。在雌性个体的性腺中注射 17β -雌二醇，通过荧 光定量 PCR 检测发现其可以诱导 Vg mRNA 的表达，证明 17β -雌二醇可以促进华贵栉孔 扇贝 Vg 的合成。通过对华贵栉孔扇贝进行鳗弧菌感染实验，发现 Vg 在鳗弧菌感染 24h 内出现先上升后下降的趋势，表明 Vg 对华贵栉孔扇贝应对细菌感染有一定相关性，可能 起到免疫防御的功能。由于类胡萝卜素可以通过干扰代谢或基因互作在基因的表达和调 I II II 节，我们推测类胡萝卜素在 Vg 行使免疫防御功能的时候起着重要作用。 本研究首次获得华贵栉孔扇贝 Vg 基因全长 cDNA 序列，同时研究了 Vg mRNA 空间 表达特性，为今后开展 Vg基因表达与调控的研究提供了理论依据；本研究首次将 Vg mRNA 表达水平和类胡萝卜素含量及总抗氧化性联系起来，给 Vg 免疫功能的研究提供了新角度； Vg 作为一种具有免疫活性的分子，在软体动物的非特异性免疫中能够发挥作用，这也为探 索贝类新的免疫途径，改善贝类养殖病害频发的现状提供了重要的基础资料。 关键词：华贵栉孔扇贝，卵黄蛋白原基因，克隆与表达，类胡萝卜素，免疫 Abstract Abstract PAGE PAGE IV Abstract The noble scallop Chlamys nobilis is famious for its vivid shell color including orange, purple, brown, orange-purple etc. It has been one of the most important cultured shellfish in south China since 1970s for its quick growth, short cult