细胞内化学组分的测定技术.pptVIP

第四章 细胞内化学组分的测定技术 一、免疫细胞化学技术 1.概念和原理 P90 是在细胞化学染色技术的基础上，吸收免疫学的理论和技术原理，发展起来的一类技术。 其基本原理是：细胞内的各种化学组分均具有特定的抗原性，用荧光素或酶，或其它标记物来标记特异抗体，通过抗原-抗体特异反应与细胞内的目标抗原特异结合，形成带有标记物的抗原-抗体复合物，成为在镜下可观察的目标，从而达到对细胞内目的抗原组分定性定量分析的目的。 2.一般实验程序 取材 标本片制备 固定 免疫组织化学染色 镜检拍照 定性定量分析 3.免疫细胞化学染色方法的分类及原理 ① 免疫荧光技术： 直接法和间接法P90-91 特点： （板图示之） 用荧光镜观察 可对细胞内抗原组分定性或定量分析 荧光标本不能长期保存，操作观察要抓紧，作好记录 ②免疫酶标技术：直接法和间接法 P92 特点： （板图示之） 普通光镜即可 对比度好，标本可长期保存 结合细胞化学方法复染，可将免疫细胞化学 结果与细胞形态学特征结合分析 可用电镜下行超微结构观察 4.免疫组化的实验准备P93 【实验用品】 1）材料：培养细胞爬片（或塗片） 2）器材：湿盒，防止免疫组化反应过程中样 品标本干燥。 包被玻片，将多聚赖氨酸包被于处理 后的载玻片表面，有助细胞 吸附。 免疫组化笔，可在标本细胞周围划 线，防抗体液外溢。 莹光显微鏡，等。 3）试剂配制：P93（介绍书中配方） 3).试剂及配制p93 PBS液：用于配制其他溶液的母液。 *注意药品溶解和定容的方法。 *区分：储液浓度10x 工作液浓度1x 反应终浓度 1%BSA溶液：用作抗体稀释液。牛血请白蛋 可减少对抗体的非特异性吸附。 50%甘油缓冲液：用于封片。 包被液：用于包被载玻片。易长菌，短期用完。 特异抗体：用抗体稀释液配制，现用现配。 4%中性甲醛：细胞固定液 【细胞处理】P94 （结合教材解读） 1)贴壁生长细胞的处理 2）悬浮生长细胞的处理 【抗体选择与配制】 1）抗体的选择：多克隆抗体，效价和特异性 及价格底。 单克隆抗体，效价和特异性 及价格高。 2）抗体的配制：P95 *抗体原液贮存：抗体原液：冻干粉或高浓度 抗体血清或腹水。 贮存：阅说明书，密封， 分装（最好一次用完） 冻存-20~-80℃. *抗体稀释液配制：P95 [1]PBS,明胶，BSA,NaN3组合液。 [2]含0.5~1％BSA的PBS溶液（PH7.4), 作抗体稀释液也可。 *抗体使用液配制：用抗体稀释液稀释分装的抗体原 液，摸索最佳抗体使用液浓度。见P95 表4-1. 【对照组的设立及意义】p96 1）阳性对照：用已知抗原阳性组织细胞作对 照，证明实验过程符合要求。 2）阴性对照：用抗原阴性的实验组作对照， 证明阳性实验结果的真实性。 5.实验步骤（以免疫莹光法为例） P96 1)细胞的固定：使标记抗体易于接近细胞中的 抗原组份而发生反应，而且保护抗原组 份的活性损失较小，并保护其自然形态 和位置。可根椐不同组织和抗原组份选 择不同