酶联免疫斑点（ELISPOT）技术综介.docVIP

酶联免疫斑点技术介绍 一、??ELISPOT技术概述1.??技术原理和技术特点ELISPOT全名为酶联免疫斑点检测，英文：（Enzyme-linked Immunospot Assay）。它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况。其技术原理，一句话概括就是：用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来（Sedgwick JD 2005）。该技术检测细胞因子具有三大优点：其一，灵敏度高。在一百万个阴性细胞中只要有一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测出来。这是目前为止，最为灵敏的检测技术，灵敏度比传统的的ELISA方法高2-3个数量级。其二，单细胞水平，活细胞功能检测。ELISPOT检测的是单个细胞分泌，而非细胞群体的平均分泌。在检测的过程中，有活细胞培养与抗原刺激阶段，检测的是活细胞的功能，而非死细胞的遗留物。其三，操作简便经济，可以进行高筒量筛选。ELISPOT没有复杂的细胞体外扩增过程，不使用同位素，不需要大型的、专门的实验仪器设备。按照标准化的实验操作，一个实验者可以同时处理数百个样品，效率远远高于其它检测方法（Kalyuzhny AE 2005）。实验设计在96孔培养板上进行，直接以培养板的塑料板底或者PVDF膜以及硝酸纤维素膜为基质，包被上特异性的单克隆抗体，用以捕获细胞分泌的细胞因子。（由于涉及到细胞培养的过程，对单克隆抗体的要求要远高于ELISA中的捕获抗体，该抗体需要无毒，不含内毒素，亲和力高等特点。）之后，在培养板的孔内加入细胞培养基（现在无血清ELISPOT技术已经成熟，培养基中可以不再含有血清）、待检测的细胞以及抗原刺激物进行培养。在特异性的抗原或者非特异性的有丝分裂原的刺激下，数小时之内，T细胞就会开始分泌各种细胞因子。细胞因子当即就被位于细胞下方的膜上的单克隆抗体所捕获。在洗去细胞之后，被捕获的细胞因子可以与生物素标记的第二抗体结合，然后用酶标亲和素再与生物素结合，进行化学酶联显色，就可以在膜的局部形成一个个圆形的斑点。每一个斑点就对应了当初一个分泌细胞因子的细胞，这些细胞被称为斑点形成细胞（Spots forming cells SFCs）。统计膜上的斑点的数目，再除以当初加入孔内的细胞总数，就可以计算出阳性细胞的频率。其实验原理如下所示：1.特异性的单克隆抗体包被在培养板的孔底部；2.封闭所能结合单瓣的其他部位；3.加入细胞及以及刺激物培养，阳性细胞分泌细胞因子，被细胞下方的单克隆抗体捕获；4.移出细胞，洗涤；5.加入生物素标记的第二抗体（和双抗体夹心法ELISA类似）；6.加入酶标链霉亲和素；7加入显色底物，在酶的催化分解下，产生不可溶的色素，就近沉淀在局部的膜上形成斑点；8.斑点计数（可以人工计数，也可以使用自动的读板仪来计数），数据处理，结果分析。 2.??ELISPOT的发展历史ELISPOT方法从创立至今已经有20多年的历史了。1983年，在地球南北两个半球地理位置相距遥远的两个研究小组几乎同时、独立的创立了这项技术。一个研究小组位于澳大利亚西部的柏斯Peth，牵头人是当时正在当地Margaret女王医院儿童医学研究所攻读博士学位的Jonathon D. Sedgwich （Sedgwick JD et. al., 1983）。另一个研究小组位于北欧瑞典城市哥德堡Gothenburg，带头人是哥德堡大学医学微生物系的学者Cecil C. Czerkinsky （Czerkinsky CC et. al., 1983a）。前者开创ELISPOT方法是为了研究B淋巴细胞分泌IgM抗体的情况（Holt PG et. al., 1984；Sedgwick JD et. al., 1984）；而后者除了用于研究B淋巴细胞分泌抗体的情况（Czerkinsky CC et. al., 1983b; 1983c），还应用于大肠杆菌分泌肠毒素（Czerkinsky CC et.al., 1983a）和成纤维细胞分泌纤维连接蛋白（Czerkinsky CC et. al., 1984）的研究中。虽然研究的对象不一样，但是该实验技术所涉及的原理以及方法步骤和我们现在的标准ELISPOT几乎完全相同。这二十多年来，ELISPOT基本技术并没有什么重大变化，但是技术进步一直没有停顿，实验材料的改进了，实验灵敏度与重复性提高了，实验应用领域也拓宽了。1)??底板材质的改进ELISPOT技术从创立之初，检测底板都是使用的普通塑料板，它的蛋白吸附能力差，因此实验的灵敏度有限。1985年，Moller SA和Borrebaeck CA 将膜板引入ELISPOT中（Moller SA et. al., 1985），检测的