第八章 特殊毒性与其试验与评价方法(1).pptVIP

第八章 特殊毒性试验及其评价 第一节 致突变作用及其试验方法与评价 第二节 生殖发育毒性作用及其试验与评价 第三节 致癌作用及其试验方法与评价 第一节 致突变作用及其试验与评价方法 一、 基本概念 二、突变类型 三、突变的发生与修复机制 四、致突变试验与致突变作用评价 自发突变 (spontaneous mutation) 是由于普遍存在的未知因素作用下，在自然条件下发生的突变。 特点：自发突变的发生过程长，频率极低 , 与物种的进化有关。 诱发突变 (induced mutation) 是指人为的造成突变 。它已被农、林、牧、渔业和园艺学家利用来培育和选择新种或良种。 特点：发生过程短，频率高，既可被人类利用，也可能对人类产生危害。 突变的分类 基因突变 (gene mutation)：一个或几个DNA 碱基对的改变。用光学显微镜观察不到，必须通过生长发育、生化、形态等表型改变来判断。 染色体畸变 (chromosome aberration)：染色体的结构及数目改变，可用光学显微镜进行观察。 染色体结构改变 染色体数目改变 容易观察到的畸变有染色单体断裂、染色体断裂、无中心粒片段、染色单体交换、双中心粒染色体、环状染色体及某些相互易位。 染色体结构变异类型 （2） 染色体数目异常 整倍性畸变：单、三、四、多倍体 非整倍性畸变：2倍体多一条或少一条或多多条或少多条 2n-1,2n-2,… 2n+1,2n+2,… 外源化学物引起基因突变和染色体突变的靶部位主要是DNA，而导致染色体数目异常的靶部位主要是有丝分裂和减数分裂器，如纺锤丝。 四、致突变试验与致突变作用评价 致突变作用（mutagenesis）：是指外来因素特别是化学因子引起细胞核中的遗传物质发生改变的能力，而且此种改变可随同细胞分裂过程而传递。 致突变物：凡能引起生物体遗传物质发生改变的化学物质或任何环境因子，又称诱变剂。又称为遗传毒物。 观察项目的选择 基因突变和染色体畸变的检测可直接反映化学物的致突变性，是评价化学物致突变性唯一可靠方法。 但是还有许多试验所观察到的现象并不直接反映基因突变、染色体畸变和染色体分离异常，仅反映致突变过程中发生的其他事件。将试验观察到的现象所反映的各种事件统称为遗传学终点(genetic mdpoint)。 致突变试验组合的原则 一组可靠的试验系统应包括每一类型的遗传学终点。如细菌回复突变试验、微核试验、染色体畸变分析和姐妹染色单体交换试验，这一组试验包括主要类型遗传学终点。 体内试验与体外试验配合。一般体内试验和体外试验各有其优缺点，应取长补短，综合考虑。 配套实验应包括多种进化程度不同的物种。如原核细胞、低等和高等真核细胞，这样更加具有说服力。 Ames试验标准试验菌株有四种：TA97和TA98检测移码突变，TA100检测碱基置换突变，TA102对醛、过氧化物和DNA交联剂较敏感。 这四个试验菌株除了含有his-突变，还有一些附加突变，检测时提高试验敏感性。 Ames试验的方法有平板掺入法，点试法及预培养法等。 突变型试验菌株可被各种诱变因素诱导，回复突变成野生型(his+) ，即恢复了合成组氨酸的能力，可在此平板上生长成可见菌落。　　 如果受试物处理组回变菌落数显著超过阴性对照组；并有剂量反应关系，即可判定受试物为鼠伤寒沙门菌的致突变物。 结果判断 只要一种试验菌株得到阳性结果，即认为受试物是致突变物。 仅四种菌株均得到阴性结果，才认为受试物是非致突变物。 不加S9混合液得到阳性结果，说明受试物是直接致突变物。 加S9混合液才得到阳性结果，说明受试物是间接致突变物。 试验步骤 染毒：健康成年ICR小鼠，实验前24小时予环磷酰胺40mg/kg体重腹腔注射。 收获细胞：处死动物前2~4h，秋水仙碱4mg/kg腹腔注射。小鼠颈椎脱臼处死，取双侧后肢股骨，纱布擦去多余肌肉和血污，剪去两端骨垢，用注射器吸NS约5 ml插入骨髓腔内，将骨髓冲入离心管，吸管吹打骨髓团块混匀，以1500 r/min离心10min，弃上清液。 低渗：打散沉淀物，加入预温37℃的 0.075 mol/L KCl约6ml，混匀，于37℃低渗15~20min，再加固定液 l~2 ml混匀，立即以1000r/min离心10min，弃上清液。 固定：重悬细胞，加入固定液4ml混匀，放置室温10~20min，然后1000r/min