第二讲2010基因工程到制药1.ppt

第一节、概述 ● 基因工程: 是通过对Nucleic acid 分子的Insert, Assemble and Recombinant而实现遗传物质（germ plasm）的重新组合，再借助Virus , Bacterium ,Plasmid or other Vectors,将Target gene转移到新的 Host Cell System,并使Target Gene在新的Host cell system 进行Replication and Expression的技术。 ● 基因工程技术最成功的成就:用于新型生物技术药物的研制 4、内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造；IL-2,125半胱氨酸—丝氨 酸提高活性及稳定性；tPA缩小分子延长半衰期 5、 利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。 6、为新药研发提供了新途径和新技术，极大的提高了药物研发速度，缩短药物研发速度。 7、促进传统制药工业的技术改造，为制药工业提供新技术 三、基因工程药物发展简史 1976年世界第一家应用DNA重组技术研究新药的公司美国Genentech公司成立。 1982年欧洲首先批准DNA重组的动物疫苗抗球虫病疫苗 1982，美国，英国批准生产和使用了第一个基因工程药物人胰岛素。 基因工程药物的种类 1、免疫性蛋白：各种抗原和单克隆抗体 2、细胞因子：干扰素，白介素，集落刺激 因子，表皮生长因子及凝血因子。 3、激素：胰岛素，心钠素，生长激素。 4、酶类：尿激酶，链激酶，葡激酶。 一、逆转录法 逆转录法就是分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA 克隆表达。 1、mRNA purification 2、合成第一链cDNA 3、cDNA第二链的合成 4、cDNA cloning： 5、将重组体导入host cell 6、cDNA library identification 7、目的cDNA 克隆的分离和鉴定 1、mRNA purification 1、首先必须考虑目的基因mRNA在特定生物组织中的丰度，一般要选择高丰度mRNA， 细胞内RNA的组成和含量: DNA:95%核内，5％细胞器 RNA：75％细胞质，10%核内，15%细胞器 rRNA80-85%;tRNA10-15%;mRNA1-5% 2、但实际操作时多用低丰度mRNA，为提高文库中目的克隆数目，要采用杂交或体外翻译系统确定RNA在组织细胞中的含量，以期得到较丰富的起始mRNA，采用琼脂糖凝胶电泳，非变性蔗糖梯度离心等方法分级收集不同长度mRNA，富集目的序列。 3、抑制RNA酶活性 2、合成第一链cDNA 一次好的逆转录反应可使oligo(dT)选出的mRNA有5—30%被拷贝。 1、 oligo(dT)引导的cDNA合成法。缺点是必须从3端起始，逆转录酶无法到达mRNA的5端，对较长的mRNA难以操作。 2、随机引物引导的cDNA合成法。根据多种可能的序列合成出6-10bp的混合物，从多位点同时进行，较易获得特长mRNA5端的序列 3、cDNA第二链的合成 1.自我引导合成法：碱水解mRNA，发卡引 导第二链的合成，S1核酸酶必须是高纯度的，否则由于单链切割作用导致5端信息丢失，极少采用。 2、RNaseH降解取代法： 3、外加引物合成法 4、cDNA cloning： 质粒载体： pUC （表达），pBR322 噬菌体DNA：gt11表达 gt10 噬菌体大于10Kb，质粒小于10Kb 大肠杆菌质粒载体 ?1．质粒pBR322质粒 质粒pBR322是经人工构建的一种较为理想的大肠杆菌质粒载体，亦是应用最为广泛的克隆载体，利用pBR322曾克隆到多种基因，虽然现在已有多种具有更优良特性的新型克隆载体逐渐代替了pBR322在基因克隆中地位，但pBR322仍是人工构建的具有几乎所有的理想特性的基因克隆载体之一。pBR322质粒是按照标准的质粒载体命名法则命名的。“p”表示它是一种质粒；而“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F．Bo1ivar和R．L．Rodriguez姓氏的头一个字母，“322’系指实验室编号，以与其他质粒载体如pBR325，pBR327，pBR328等相区别。 （2）pBR322质粒载体的优点 2．pUC质粒载体 pUC载体是在pBR322质粒载体的基础上，组入了一个在其5，端带有一段多克隆位点的lacZ基因，而发展成为具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。 （2） pUC质粒载体的优点 与pBR322质粒载体相比，pUC质粒载体系