第14章基时因工程.pptVIP

第 二 节 重组DNA技术 相关概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体 基本原理 重组DNA技术与医学的关系 （二）工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ T4DNA连接酶 逆转录酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 （三）目的基因 （target DNA）－“乘客” 基因组DNA (genomic DNA) 一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点（MCS）； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 （一）目的基因的获取 1. 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。小分子多肽基因 2.基因组DNA文库(genomic DNA library) 3. cDNA文库(cDNA library) 4. 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR) （见第22章） Dr. Karry Mullis 1985年发明，获1993年度诺贝尔化学奖PCR (Polymerase chain reaction) 是用一对寡聚DNA作为引物，通过加温变性－退火－DNA合成的多次循环，使目的DNA片段得到扩增。由于这种扩增产物是以指数形式积累的，经25－30个循环后，扩增倍数可达106。 三、重组技术与医学的关系 小 结 1. 重组DNA技术（基因工程）： 分、切、接、转、筛 2. 分子医学涉及的内容 表达体系的建立 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化 （六）克隆基因的表达 原核表达体系 真核表达体系 标准：选择标志 强启动子 翻译调控序列 多接头克隆位点 原核表达体系 （E.coli表达体系最为常用） E.coli表达体系的不足 不宜表达真核基因组DNA 不能加工表达的真核蛋白质 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion body) 很难表达大量可溶性蛋白 大鼠胰岛素原cDNA 的表达和分泌 目 录 优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 使用穿梭载体，有两套复制原点及选择标记 缺点：操作技术难、费时、不经济 转染 —— 将表达载体导入真核细胞的过程 方法：磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 脂质体转染 显微注射 2. 真核表达体系 酵母、昆虫、哺乳类动物细胞 表达载体pFASTBACI 的物理图谱 目 录 （一）疾病基因的发现与克隆 根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。 （二）生物制药 分子医学 molecular medicine 重组DNA医药产品 预防霍乱 口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗 预防乙肝 乙肝疫苗(CHO, 酵母) 利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗 单克隆抗体 抗组织损伤 超氧化物歧化酶 激活、剌激各类白细胞 白细胞介素 抗病毒感染及某些肿瘤 干扰素(? 1b, ?2a, ? 2b, ?) 治疗糖尿病 胰岛素 治疗侏儒症 生长素 刺激细胞生长与分化 生长因子(bFGF, EGF) 剌激白细胞生成 促红细胞生成素 剌激白细胞生成 颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子 促进凝血 血液因子VIII 抗凝 组织胞浆素原激活剂 功 能 产 品 目 录 基因诊断(genetic diagnosis)是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。 （三）基因诊断 基本过程 区分或鉴定DNA的异常 分离、扩增待测的DNA片断 1. 质粒 (plasmid) 质粒：存在于细菌染色体之外的能独立自主复制环状双链DNA分子。带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状 目 录 ori λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆） 2. 噬菌体(phage) M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因的N端） M13mp系列 pUC系列 3. 粘性质粒(cosmid) 一种人工构建的克隆载体，包含了λ噬菌体的cos基因。能被包装到λ噬菌体粒子中，感染大肠杆菌；它携带入宿主细菌的DNA片段（超过45kb）要比质粒载体携带的要大 酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC)