实验三1血清蛋白信含量测定.pptVIP

动 物 生 物 化 学 实 验 实验三 血清蛋白含量测定 一、 实验目的 学习光谱光度法测定物质含量的原理 掌握考马斯亮蓝染料结合法测定蛋白质 含量的基本原理和技术 二、实验原理 1. 光谱光度技术原理 Lambert-Beer定律 Lambert指出： 当一定的光线（I0）通过呈色溶液时，如果溶液的浓度（C）是一定的，则透过光线的强度（I）随通过液层的厚度（L）的增加成指数函数的减少，即 I=I0×10-KL 合并上两式： I=I0×10-KCL 取对数： -lgI/I0 = KCL A(OD) = -lgT = -lgI/I0 = lgI0/I = KLC 故Lambert-Beer定律可表述为：当一单色光透过呈色溶液时，光密度或消光度与被测溶液的浓度，液层的厚度成正比；透光度的对数与其成反比。 A(OD) = -lgT = -lgI/I0 = lgI0/I = KLC 据Lambert-Beer定律，当液层厚度单位为cm，浓度单位为mol/L时，吸光系数K称为摩尔吸光系数(ε)。 ε的意义是：当液层厚度为1cm，物质浓度为1mol/L时，在特定波长下的吸光度值。ε是物质的特征性常数。 A(OD) = εLC 2.分光光度法的定量分析 直接计算法： A(OD) =εLC C = A/εL 标准管法 ： 对同一物质，在特定测定条件下， ε是相同的常数 A(OD)标 = εLC标 A(OD)未 = εLC未 标准曲线法： 分光光度计的使用 （3）将空白液、校准液或待测液放入比色池，将空白液置于光路中。 （4）将开关置于T位，打开比色池盖子，用光量粗调和光量细调调节T为0.0,关上比色池盖子，调节T为100.0。 （5）将开关置于A，用消光调零调节A为0.0 (6) 将校准液或待测液推入光路，测量溶液的吸光度（A） 5.蛋白含量测定-----染料结合法实验原理 在酸性条件下，蛋白质分子可解离出带正电荷的 -NH3+，可同考马斯亮蓝G-250产生颜色反应，最大吸收为595nm，该方法操作简单，重复性好，最低测定值为1μg。 三、实验试剂： 1. 标准蛋白液：1mg/ml的牛血清白蛋白 2. 显色剂：100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml、95%乙醇中，再加入100ml磷酸，然后用蒸馏水稀释至1000ml。 3. 样品液：稀释50倍的牦牛血清 四、实验操作： 取试管3支，按下表操作 五、实验结果及分析 * * 利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱谱系的特征，以此来确定物质性质、结构或含量。 光谱分析技术分类： 发射光谱分析技术：火焰光度法、原子发射光谱法和 荧光光谱法 吸收光谱分析技术：紫外、可见光分光光度法，原子 吸收分光光度法和红外光谱法 散射光谱分析技术：比浊法 吸光度与透光度 A = -lgT = -lgI/I0 = lgI0/I 当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分光被散射，一部份光被吸收，另有一部分光透过溶液。设入射光强度为I0，透射光强度为I，I和I0之比称为透光度，即： T = I/I0 T×100为T%称为百分透光度。透光度的负对数称为吸光度即： Beer指出：当液层厚度（L）一定时，透过光线的强度随吸收光线物质浓度（C）增加而成指数函数的减少，即： I=I0×10-KC I0 I 式中A为吸光度或光密度（optical density),也可用OD表示；K为比例常数，称为吸光系数；L为溶液层厚度，称为光径；C为溶液浓度 C未= [A(OD)未 / A(OD)]标 × C标 C OD 配制一系列浓度的标准品溶液，按标本处理方法作相同处理，在特定波长下测定吸光度，以标准液浓度为横座标，以吸光度为纵座标，将对应各点连成一条通过原点的直线，这条直线称为标准曲线。待测溶液测定吸光度后，从标准曲线上可查出其相应的浓度。 制作和应用标准曲线时应注意下面几点： （1）测定条件发生变化时（如更换标准品和试剂等），应重新 绘制。 （2）标准品应有高的纯度，标准液的配制应准确。 （3）当待测液吸光度超过线性范围时，应将标本稀释后再测定。 （4）标本测定的条件