华蟾素诱导人宫颈癌caski细胞免疫原性死亡的实验分析-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

三峡大学硕士学位论文 三 峡 大 学 硕 士 学 位 论 文 II II 内 容 摘 要 目的：探讨抗癌中药华蟾素对宫颈癌 Caski 细胞免疫原性死亡的影响，为建立抗 癌中药诱导的肿瘤细胞免疫治疗新方法提供理论支持和实验数据。 方法：(1) MTT 法分析细胞增殖；(2)流式细胞术分析细胞周期和鉴定凋亡细胞； (3)琼脂糖凝胶电泳分析 DNA 片段化；(4)Western Blot 分析不同浓度药物处理后细胞 胞浆中细胞色素 C 的含量；(5)荧光显微镜下观察细胞中活性氧的含量变化；(6)多功 能荧光酶标仪检测线粒体膜电位；(7)细胞划线实验分析细胞的迁移能力；(8)免疫荧 光和流式细胞术检测细胞膜上钙网蛋白的表达。 结果：(1)华蟾素能够显著性抑制Caski细胞的增殖和迁移能力，抑制效应呈时间 和剂量依赖性，其48h小时的半数抑制浓度值（IC50）为1.68?g/ml；(2)华蟾素干扰细 胞周期，G2/M期细胞比例显著性升高，G1期细胞比例显著性下降，同时凋亡细胞数 量大幅增加；(3)华蟾素处理后，细胞染色体DNA出现凋亡细胞典型的DNA片段化现 象，同时伴有细胞线粒体膜电位降低、细胞色素C由线粒体向细胞质释放；(4)与对照 组相比，经华蟾素处理组细胞内活性氧含量明显增加；(5)细胞划痕实验表明华蟾素 能够抑制细胞的迁移；(6)华蟾素能够诱导钙网蛋白(CRT)发生膜转位。 结论: 华蟾素具有抑制人宫颈癌Caski细胞增殖的药理活性，其机制与抑制细胞 周期和诱导细胞凋亡有关, 并且华蟾素能够诱导钙网蛋白从肿瘤细胞内转位到细胞膜 上并发生簇集。提示，华蟾素能诱导Caski 细胞发生免疫原性死亡，由此导致的抗肿 瘤免疫活性可能是华蟾素在肿瘤患者体内有效杀伤肿瘤细胞的药理学机制之一。本研 究结果有助于进一步阐明华蟾素抗癌作用的药理学机制，为建立抗癌中药诱导的肿瘤 免疫治疗新方法提供了理论支持和实验数据 关键词：华蟾素 宫颈癌细胞 细胞凋亡 钙网蛋白 III III Abstract Objective: To investigate effects of cinobufacini on immunogenic death of human Caski cervical cancer cells and to provides the basic experimental data and theoretical supports for establishment of the new immunotherapy method mediated by traditional anti-tumor Chinese medicines. Methods: (1)MTT was used for the analysis of cell proliferation; (2)The Flow cytometric assay was used to identify cell cycle and apoptotic cells; (3)The agarose-gel electrophoresis was performed to evaluate DNA fragmentation; (4)Western Blot was used to analyze the expression of cytochrome c; (5)The production of reactive oxygen species(ROS) was determined by Flurescence microscope; (6)The multifunctional fluorescent microplate detected the levels of mitochondrial membrane potential; (7)The cells crossed experimental was used to analyze of cell migration; (8)Immunofluorescence and The Flow cyctometry were used to detect the exposure of Calreticulin (CRT) on the cell surface. Results: (1)Cinobufacini inhibited proliferation and migration of Caski cells significantly in the time- and dose-dependent manners. The median inhibition concentration (IC50) at