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河南科技大学 第十一章 动物基因工程 第一节 基因工程概述 理论上的三大发现 DNA为遗传物质：Avery的肺炎双球菌转化实验 DNA双螺旋结构的发现和DNA半保留复制机制 遗传密码与中心法则 3、基因工程的内容 目的基因的获得 目的基因与载体的连接成重组DNA分子 重组DNA分子导入受体细胞 筛选重组克隆 基因表达与产物分离 一、限制性内切酶的概述 （一） 概念 限制性核酸内切酶简称限制性内切酶，是一类能识别双链DNA中特定核苷酸序列并具有专一切割位点的脱氧核糖核酸水解酶。 主要存在于细菌、霉菌中，至今已分离到1000种以上，搞清识别序列的有300种以上。 （四） II 型限制性内切酶的特性 （1）II型限制酶的识别特异性 ? 回文识别序列 II型限制酶的识别序列大多是具有 双重对称结构性结构,或称回文序列 (Palindromic Sequence) 大肠杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ 1．E.coli DNA 聚合酶 Ⅰ 的活性 ① 5‘--3’ DNA 聚合酶活性。 ② 5‘--3’ 外切核酸酶活性。 ③ 3--5 外切酶活性。? 2．E.coli DNA 聚合酶 Ⅰ 的用途 ?① 利用 E.coli DNA 聚合酶 Ⅰ 的 5‘--3’ 外切核酸酶活性，可用切口平移法（nick translation ）标记 DNA ，所有 DNA 聚合酶中只有此酶有此反应。 ② 用于 cDNA 克隆中的第二链，即单纯的 DNA 聚合活性。但由于具有 5‘--3’ 外切活性，现在已不再使用，而改用 Klenow 酶和反转录酶（详见后面）。 ③ 对 3‘ 突出端的 DNA 作末端标记（交换或置换反应），但是此反应用 T4 或 T7 DNA 聚合酶效果会更好 。 （二）Klenow DNA 聚合酶 无5’→3’外切活性 有聚合活性 有 3’→ 5’外切活性 由于没有 5--3外切活性，使用范围进一步扩大 Klenow DNA 聚合酶用途 ① 补平 3’ 凹端 DNA 。 ② 抹平 DNA 3’凸端。? ③ 通过置换反应对 DNA 进行末端标记。 ④ 在 cDNA 克隆中合成第二链。 ⑤ 随机引物标记。 ⑥ 应用于 Sanger 双脱氧链末端终止法的 DNA 测序。 ⑦ 应用于 PCR 反应，现在已经被 Taq DNA 聚合酶等取代。 ⑧ 在体外诱变中，用于从单链模板合成双链 DNA 。 （三）T4 噬菌体 DNA 聚合酶 T4 噬菌体 DNA 聚合酶来源于 T4 噬菌体感染的 E.coli ，分子量114kDa 。 T4 噬菌体 DNA 聚合酶与 Klenow 酶相似，但 3‘--5’ 外切活性强 200 倍，且不从单链 DNA 模板上替换引物，因此在诱变反应中更有用，诱变率约提高 1 倍。 （六）末端转移酶 来源于小牛胸腺 催化 dNTP 加于 DNA 分子的 3‘ 羟基端 dNTP 为 T 或 C ，二价阳离子首选 CO 2+；为 A 或 G 首选 Mg 2+ 对 3‘ 羟基突出末端的底物作用效率最高 在 cDNA 或载体 3‘ 末端加同聚尾用于克隆 用标记的 rNTP、 dNTP 或 ddNTP 来标记 DNA 片段的 3 末端。 3、核酸酶 （nuclease） 核酸外切酶：可降解dsDNA中或DNA-RNA中的一条链 核酸内切酶：可切割DNA链中的单链 （1）BAL31 核酸酶（BAL31 nuclease）：来源于交替单胞菌 ，主要活性为 3 外切核酸酶活性，可从线性 DNA 两条链的 3 端迅速去除单核苷酸，随后可从单链 DNA 内部发挥缓慢的内切酶活性，形成截短了的平端双链 DNA 分子（约占 10-20%）以及带有约 5 个核苷酸突出单链的截短分子（约占 80-90%）。对于所形成的单链突出，可用 DNA 聚合酶补平。 （2）Sl 核酸酶（S1 nuclease） Sl 核酸酶来源于米曲霉，可降解单链 DNA 或 RNA ，是一种单链核酸酶。产生带 5 磷酸的单核苷酸或寡核苷酸双链，对 dsDNA、 dsRNA 和 DNA:RNA 杂交体不敏感。酶浓度大时可完全消化双链，中等浓度可在切口或小缺口处切割双链。??? 该酶可用于分析 DNA:RNA 杂交体的结构，去掉双链核酸中突出的单链尾从而产生平末端，打开双链 cDNA 合成中产生的发荚环。 （3）脱氧核糖核酸酶 Ⅰ （DNase Ⅰ） ?DNase Ⅰ 来源于牛胰，是内切核酸酶，可优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链 DNA 。在 Mg 2+ 存在下，独立作用于每条 DNA 链，且切割位点随机