鸭群中禽白血病病毒的义核酸检测分析.docx

符号及缩略词 符号及缩略词 ‘～警卿 英文缩写 英文全称 中文名称 rpm REV rotation per minute Reticuloendotheliosis virus 转/分钟 禽网状内皮增生病病毒 RSV s Rouss缸coma virus second 劳斯肉瘤病毒 秒 SDS Sodium dodecyl sulphate 十二炕基硫酸铀 SPF Specific pa也ogen 企ee 无特定病原 μg mIcrogram 微克 μL microliter 微升 目录中文摘要 目录 中文摘要 ．I Abstract ．II 1弓l言 ．1 1．1禽白血病的研究概述 ．．1 1．2病原学 2 1．2．1分类 。2 1．2．2病毒形态 一 2 1．2．3化学组成 3 1．2．4基因组结构与功能 3 1．2．5病毒复制 5 1．2．6毒株分类 6 1．2．7内源性白血病病毒 7 1．3流行病学 。8 1．3．1发病率 8 1．3．2传播方式 8 1．4病理生物学 。9 1．4．1临床症状 9 1．4．2病理变化 ．9 1．5禽白血病的检测和诊断 lO 1．5．1病原分离和鉴定 ．．11 1．5．2聚合酶链式反应(PCR) ．11 1．5．3血清学检测 ．．12 1．5．4鉴别诊断 。12 1．6致肿瘤机制 1 3 1．7预防和控制 14 1．7．1净化原代种鸡场 14 1．7．2保持鸡群对ALV的高度洁净状态 14 1．7．3政府部门强化种鸡群的监控 15 1．8本研究的背景、目的及意义 1．8本研究的背景、目的及意义 15 2材料与方法 。16 2．1鸭群中禽白血病病毒p27基因的核酸检测 16 2．1。1材料 16 2．1．1．1鸭组织样品 ．16 2．1．1．2菌种和载体 ．16 2．1．1．3主要试剂 ．16 2．1．1．4主要仪器 “． 16 2．1．1．5常规试剂及配制 ．16 2．1．2方法 1 8 2．1．2．1引物设计与合成 ．18 2．1．2．2组织DNA的提取 ．1 8 2．1．2．3目的片段的PCR扩增和纯化回收 18 2．1．2．4目的片段与载体的连接 19 2．1．2．5 DH5a大肠杆菌感受态细胞的制备 ．．20 2．1．2．6连接产物的转化 20 2．1．2．7质粒DNA的提取 ．．20 2．1．2．8重组质粒酶切鉴定 。21 2．1．2．9阳性克隆序列的测定 22 2．2禽白血病病毒env基因的PCR扩增 22 2．2．1材料 22 2．2．2方法 ．： ．22 2．2．2．1引物设计与合成 ．22 2．2．2．3目的片段与载体的连接 ．22 2．2．2．4 DH5a大肠杆菌感受态细胞的制各 一22 2．2．2．5连接产物的转化 ．22 2．2．2．6质粒DNA的提取 。22 2．2．2．7重组质粒酶切鉴定 ．22 2．2．2．8阳性克隆序列的测定 ．22 2．3 ALV-B单因子血清的制备 22 2．3．1材料 2．3．1材料 22 2．3．2方法 23 2．3．2．1设计引物 23 2．3．2．2四段基因的PCR扩增和纯化回收 23 2．3．2-3目的片段与载体的连接 ．23 2．3．2．4 Rosetta(DE3)PLys感受态细胞的制备 23 2．3．2．5连接产物的转化 ．24 2．3．2．6重组质粒DNA的提取 。24 2．3．2．7重组质粒的PCR鉴定 。24 2．3．2．8重组质粒的诱导表达 24 2．3．2．9表达蛋白的SDS．PAGE检测 24 2．3．2．10重组蛋白的大量表达和纯化 ．．26 2．3．2．11免疫疫苗的制备及免疫 ．26 2．4四种单因子血清分别与A、B和J型ALV分别作IFA区分鉴定 27 2．4．1材料 27 2．4．2方法 27 2．4．2．1病毒感染细胞DNA的提取及ELISA检测 27 2．4．2．2单因子血清对已知删诅、ALV-B与ALV-J的间接免疫荧光(IFA) 鉴定 29 3结果与分析 。30 3．1鸭群中禽白血病病毒p27基因的核酸检测 30 3．1．1 p27基因的PCR扩增结果 。30 3．1．2ALV P27基因在不同地区鸭群中的携带率分析 30 3．1．3 p27基因的测序结果 31 3．2 env基因的PCR扩增 ．32 3．2．1 env基因的扩增结果 32 3．2．2 env基因的序列比对结 33 3．2．3 cnv基因与ALV参考株cnv基因的同源性分析结果 ．．35 3．3 ALV-B单因子血清与A、B和J型ALV分别作IFA区分鉴定 35 3．3．1四段基因的PCR扩增结果 ．35 3．3．2四段基因重组质粒的PCR鉴定 3．3．2四段基因重组质粒的PCR鉴定 36 3．3．3 SDS．PA