基因转移技术和上基因打靶技术.pptx

第十章 基因转移技术和基因打靶技术; 基因剔除动物是指运用基因剔除技术将特定 的内源基因剔除后的动物。 基因剔除是指外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组而整合到受体细胞的基因组中，是特定的内源基因被踢除。 基因替换动物是指运用基因锲入技术，使外源基因编码区取代与某种生理现象相关的基因编码区后获得的动物。 基因锲入技术（基因置换技术）是指使双链DNA的断裂点发生在同源序列的边缘或者同源序列之外，是外源DNA取代内源靶序列的新技术。 ;;转基因动物制作的关键技术包括： 1.外源目的基因的分离 2.转基因与包含启动子、增强子、报告基因等元件的载体拼接重组 3.重组的转基因导入生殖细胞或胚胎干细胞 4.转基因胚胎的培养和移植 5.转基因胚胎发育生长的鉴定及转基因动物品系的筛选 6.外源目的基因整合率及表达效率的检测;第二节 动物转基因技术的基本原理与方法;一、目的基因的制备和转基因载体的构建 （一）目的基因的制备 1、cDNA法扩增目的基因 2、双链DNA与载体连接构建重组体 3、将重组体转入受体菌 4、筛选和鉴定重组体 5、扩增获得大量重组体;（二）转基因载体的构建 载体通常由结构基因及其调控序列组成。常常在载体中附加半乳糖苷酶或绿色荧光蛋白等报告基因。 根据不同目的选择相应调控序列：如观察外源基因表达的生物学效应，即选择表达效率高而无组织特异性的强启动子如CMV、pGK等。如观察外源基因再特定靶器官的功能，即选择组织特异的启动子。 线性DNA分子比环形DNA分子更容易整合到染色体上。;（一）显微注射法;（二）反转录病毒法 ;步骤： 1.反转录病毒载体的构建 2.选择和培养包装细胞系 3.重组病毒DNA导入包装细胞 4.收集重组病毒颗粒 5.感染胚细胞，使细胞转化 此法是目前制备转基因鸡最有效和最成功的方法。;（三）精子载体法;（四）电穿孔法;（五）体细胞核移植法;（六）受体介导法;（七）磷酸钙沉淀法： 目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的DNA微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，并整合到受体细胞基因组中，在适当条件???得以表达。;（八）脂质体载体法;（九）嵌合体动物法 嵌合体是由基因型不同的细胞构成的复合体个体。动物嵌合体技术有卵裂聚合法和囊胚注射法。 胚胎嵌合体的制造方法主要有卵裂聚合法和囊胚注射法。卵裂聚合法是把遗传性能不同而发育阶段相或相近的胚胎卵裂球聚合在一起，通过发育形成嵌合体动物。囊胚注射法是把一种或多种胚胎的卵裂球、内细胞团、胚胎干细胞等直接注射到一个囊胚的空隙中，从而获得嵌合体动物。 ;三、转基因动物的检测 利用PCR或者Southern印迹杂交。;第三节 动物基因打靶技术的基本原理与方法;基因打靶的技术基础：;一、胚胎干细胞系的建立 （一）胚胎的收集与胚泡的培养 分离胚胎，体外培养胚胎形成胚泡。 （二）内细胞团（ICM）的离散 （三）干细胞克隆的识别 （四）干细胞的收集与传代培养 （五）干细胞的冻存与复苏 （六）ES细胞系的特征;二、基因打靶;基因敲除的基本程序;基因打靶在医学中的应用