东方巴贝斯虫新型诊断方法的建立和基因组序列测定与分析-预防兽医学专业论文.pdf.docxVIP

华中农业大学博士学位论文(2)且∥彪刀纪凰环介导恒温扩增(L舢Ⅲ，)检测方法的建立 华中农业大学博士学位论文 (2)且∥彪刀纪凰环介导恒温扩增(L舢Ⅲ，)检测方法的建立 依据东方巴贝斯虫18S rRNA的v4高变区，用I，AMP引物设计专用软件，设计 4条识别目的片度6个特异性位点的引物，建立东方巴贝斯虫U蝴P快速诊断方法。 特异性试验表明，圳P仅能扩增东方巴贝斯虫的DNA模板，而与其他的梨形虫 DNA无任何特异性扩增。用该方法检测77份长江以南、88份长江以北的水牛血液 样品和66份非洲水牛样品。结果表明，南非水牛样品全部阴性，77份长江以南和 88份长江以北的样品，U山但检测的阳性分别是24份和6份，半巢式PCR检测的 阳性分别是12份和1份。检测结果表明本研究成功建立了特异性高、敏感性强、快 速简便的东方巴贝斯虫L√6山口检测方法，流行病学调查和统计分析显示，本试验建 立的L脚方法比此前报道的半巢式PCR更敏感，且东方巴贝斯虫已经从长江以 南流行到长江以北。 (3)最D，．把，z砌凰实时定量检测方法的建立 利用东方巴贝斯虫18S rRNA的v4高变区设计TaqMan实时定量PCR的引物和 探针，建立东方巴贝斯虫的实时定量PCR检测方法(1细MaIl real．缸1e PCR)。该方法 的检测极限是每微升2个虫体，特异性试验表明仅东方巴贝斯虫DNA有特异性的 扩增曲线。用实时定量PCR和RLB分别检测180份湖北地区的水牛血液样品。结 果表明，两种方法分别检测的阳性样品分别为28份和21份，其中长江以北分别检 出16份和12份阳性；阳性样品的染虫率范围是2．O×105～2．O×100，其中有16份 的染虫率为2．O×103～2．O×102。试验结果表明所建立的实时定量PCR方法能有效、 定量检测东方巴贝斯虫。 (4)丑D，．话胛舰泌免疫相关基因的克隆表达 利用东方巴贝斯虫阳性血清筛选东方巴贝斯虫cDNA文库，共得到18个阳性克 隆子，经EST序列分析，挑选其中的3个可能与免疫相关的基因：B04_核动蛋 白基因、B05——嘏定蛋白基因和B41——热休克蛋白70基因(HSP70)，克隆各自 的ORF，分别构建原核表达载体pE暑32a-B04，pET-28a．B05和pET．32a-B4l，在 Ros铲中高效表达，表达产物经纯化后weSt锄blot分析，结果表明三个基因都有 良好的抗原性，且证明了HSP70在东方巴贝斯虫中的存在。HSP70基因的核苷酸序 列进化分析表明东方巴贝斯虫是一归属于巴贝斯虫的独立新种。 (5)最D，．据聆砌凰基因组测序 Ⅱ 东方巴贝斯虫新型诊断方法的建立和基因组序列测定与分析本试验对东方巴贝斯虫基因组采用的Pair_end双末端测序进行了Solexa测序。 东方巴贝斯虫新型诊断方法的建立和基因组序列测定与分析 本试验对东方巴贝斯虫基因组采用的Pair_end双末端测序进行了Solexa测序。 共获得23，898，916个读长，测序数据量为2，389，891，600，测序深度约为306．5倍。 剔除污染和低质量的读长，组装拼接后共获得1284个Sca助ld，总长度为7，796，224 bp，GC含量42．4％，与已发表的牛巴贝斯虫T2B株基因组GC含量41．8％相一致。 结合本试验分析的结果和已报道的牛巴贝斯虫和小泰勒虫基因组信息，分析东方巴 贝斯虫有4条染色体，基因组大小约为7．9 Mb。由于真核生物基因组非常复杂，而 且目前所能参考的梨形虫基因组信息相对有限，对东方贝斯虫基因组的具体注释还 有待进一步研究。 (6)丑D心珂细凰线粒体基I司组(mitochon“on DNA’m1DNA)克隆和多态性分析 根据基因组测序的高通量序列和cDNA文库钓取的部分mtDNA序列，结合 NCBI公布的顶器门血液原虫mtDNA序列，选择其保守区设计引物，克隆东方巴贝 斯虫mtDNA并做多态性分析。测序结果用Stadenpackage软件进行拼接，Anemis v11 对东方巴贝斯虫的mtDNA进行注释。结果表明，东方巴贝斯虫mtDNA与已报道的 巴贝斯虫和泰勒虫mtDNA相似，也含有3个编码区，即细胞色素氧化酶I(COX I)， 细胞色素氧化酶III(COX III)和细胞色素b(cytochrome b，Cytb)，其大小分别为1428 bp，687 bp和1092 bp，其中COX I位于正义链，COX III和Cytb均位于反义链上。 mt肼町A的COX I、Cytb以及COX I和Cytb结合序列的系统进化分析结果表明三种 序列得到的结果与18S rRNA基因和热休克蛋白70(HSP70)基因进化分析的结果一 致，即东方巴贝斯虫归属于巴贝斯虫分支。东方巴贝斯虫mtDNA的多态性分析发 现其有99个