人源iPSC中致聋基因MYO15A的修正对诱导获得的毛细胞样细胞的形态和功能的影响-细胞生物学专业论文.pdf.docxVIP

浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得堂望盘茔或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中 作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：豫76·禾 签字日期： ‰l I，年f 1，月I乡日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝姿盘堂有权保留并向国家有关部门或机构 送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝婆盘堂可 以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 (保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 髀而埠 导师签名： 签字日期： 似fS年f t月f；日 签字日期： 切lf年I≯月侈日 万方数据 致谢光阴似箭，五年紧张而又充实的直博生涯即将结束，值此博士毕业论文完成 致谢 光阴似箭，五年紧张而又充实的直博生涯即将结束，值此博士毕业论文完成 之际，我要向所有支持、关心、帮助过我的人们表示最诚挚的谢意! 首先，我必须要感谢我的导师王金福教授。五年以来王金福教授的谆谆教诲 和悉心栽培，使我获益良多，王教授渊博的学识，严谨的治学，认真勤奋的工作 作风，为我树立了良好的榜样，为我以后的人生道路点亮了一盏明灯。 其次，我要感谢管敏鑫老师，邵建忠老师，杨万喜老师，赵晓立老师，项黎 新老师，黄晓老师以及陈平老师对本研究提供的宝贵意见以及建议，使我在迷雾 之中豁然开朗，少走了不少弯路。 感谢实验室的兄弟姐妹：石东燕、刘立跃、宗晨、阮峰、唐子华、柳全文、 丁洁、陈键、张翠、陈建玲、李亮以及王翠翠给与我的支持和帮助，与大家在一 起的日子愉快又充实，我将铭记于心。 感谢陈汉明老师，张麝龙老师，黄方亮老师，朱瑞建老师，郑静师姐，石昊 松同学对我实验的帮助，没有你们的帮助，我的实验不能那么顺利地完成。 感谢我的父母这些年来的默默支持，养育之恩，无以为报。 最后，感谢各位评审老师提供的宝贵意见，谨以此文献给所有关心我、爱护 我和给予我帮助的人们! 万方数据 摘要耳聋和听力障碍是全球性重大健康问题之一。耳是人类重要的听觉以及平衡 摘要 耳聋和听力障碍是全球性重大健康问题之一。耳是人类重要的听觉以及平衡 器官，内耳毛细胞是听觉转换的关键感觉细胞。当声波经过的时候，毛细胞通过 其表面静纤毛的摆动，将声波信号转换为电信号，并由神经传给大脑，从而产生 听觉。内耳毛细胞的损伤或丢失是诱发耳聋和听力丧失的主要原因之一。噪音、 衰老、基因突变或药物滥用(尤其是氨基糖苷类抗生素)都可能会导致内耳毛细 胞损伤或丧失。在哺乳动物中，包括人类，内耳毛细胞一旦遭到破坏，将无法再 生。这将导致永久性耳聋。研究耳聋的发病机理，探索如何在哺乳动物(以至于 人类)中再生正常内耳毛细胞，这将为治疗耳聋或听力丧失提供帮助。 诱导多能干细胞(iPSC)是一类性状极其类似于胚胎干细胞(ESC)的多能 干细胞。规避伦理问题，分化能力的全能性，无限的扩增能力，获得病人特异iPSC 的能力以及自体移植不存在免疫排斥的效应，这些种种优势都使iPSC在再生医 学，疾病模型以及药物筛选等领域拥有广阔的应用前景。基因编辑技术的出现， 尤其是CRISPR／Cas9技术的快速发展，使人类能够随心所欲的改造或是修正基 因。近几年来内耳毛细胞再生研究的突破性进展，使哺乳动物毛细胞再生方法日 趋成熟。本研究中，通过iPSC技术，我们建立了致聋基因MY015A突变的iPSC 细胞系；通过CⅪSP脱as9技术，我们将脚J，鲥突变iPSC细胞系中的MY015A 基因进行了修正；通过将iPSC体外诱导分化毛细胞，我们证明了MY015A的基 因校正逆转了由MY015A突变导致的毛细胞样细胞的形态和功能缺陷。 第一部分：通过逆转录病毒，我们将来源于MY015A突变耳聋病人(脚J鲋 c．4642GA，c．8374GA)，病人父亲(脚J鲋c．8374GA)以及一个听力正常 女孩的成纤维细胞诱导成了iPSC(分别为M／iPSC、M+／-iPSC和u+／+iPSC)。三株 iPSC都表现出与ESC类似的特性，例如AP阳性，表达多能干细胞特异性标志 蛋白OCT4，SOX2，NANOG，SSEA4，TRA．1．60以及TRA．1．8l，具有体内外 三胚层分化的潜能。同时对这三株iPSC的核型进行了检测，结果显示，在经过 重编程的漫长过程后，三株细胞系都保持了正常的核型。 第二部分：通过单层贴壁诱导法，我们将三株