重组体的筛选专第四章.ppt

第四章 重组体的筛选 （Recombinant Screening) 第一节 重组 DNA导入受体细胞 一、外源DNA片段同载体分子的重组 二、受体细胞 三、重组 DNA导入受体细胞的方法 四、转化(transformation) 第二节 重组体的筛选 一、遗传表型筛选法（Genetic phenotype selection ） 二、电泳筛选法（Electrophoresis selection） 三、分子杂交检测法（Molecular hybridization selection） 四、免疫化学检测法（Immunochemical selection） 五、亚克隆法 （Subcloning selection ） 第一节 重组 DNA导入受体细胞 一、外源DNA片段同载体分子的重组 1、外源DNA片段同载体分子的连接方法 （1）平末端 （2）粘性末端 衔接体（linker) 结合体 （adaptor) 同聚体加尾 （homopolymer） 二、受体细胞 1、受体细胞(receptor cell)的概念 2、受体细胞的选择原则 1）便于重组DNA的导入 2）能使重组DNA分子稳定存在于细胞中 3）便于重组体的筛选 选择与载体所含的选择性标记相匹配的受体细 胞基因型 4）遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长 5）安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染 6）选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞，利于外源基因蛋白表达产物在细胞内的积累。 7）受体细胞在遗传密码的应用上无明显的偏好性 编码氨基酸的同义密码子之间的选择是有偏好的。植物的叶绿体和线粒体基因在同义密码子第三位上偏好使用A、U 8)具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达 9)在理论研究和生产实践上有较高的应用价值 （一）原核生物细胞 1、理想的受体细胞类型 1）没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA的进入 2）没有核膜，染色体 DNA没有固定结合的蛋白质 3）基因组简单，不含线粒体和质体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析 4）单细胞生物 缺欠： 1、不具备真核生物的蛋白质折叠系统 2、缺乏真核生物的蛋白质加工系统 3、内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源 蛋白，造成表达产物不稳定。 大肠杆菌、枯草杆菌、蓝细菌 枯草杆菌 1) 枯草杆菌具有胞外酶分泌—调节基因 2）不产生内毒素 3）具有芽孢形成能力 （二）真菌细胞 1）简单的真核生物 2）蛋白质翻译后的修饰加工系统 3）不含特异的病毒，不产生毒素 4）培养简单 5）外源基因表达产物分泌至培养基中 （三）植物细胞 全能性 （四）动物细胞 1）识别除去外源真核基因中的内含子 2）翻译后能能被正确的加工与修饰 3）易被重组DNA质粒转染 4）产物分泌到培养基中 三、重组 DNA导入受体细胞的方法 1) 转化（transformation） 2) 转染（transfection） 3) 显微注射技术（microinjection） 4)电转化法（electro-tranformation）,也称为电穿孔（electroporation） 5）基因枪法（gene gun/particle gun），又称微弹轰击（micro-projectile bombardment） 6）脂质体介导法（liposome mediated gene transfer） 7）花粉管通道法 质粒的不相容性(incompatibility) 每个细菌细胞只能导入一个质粒DNA分子； 每个菌落（一个单克隆）都是由一个细菌细胞形成的； 每个克隆中所有的细胞都只含有同一种质粒 2、受体细胞的感受态 （1）感受态细胞（competent cell)的概念 （2）感受态的机制 局部原生质体化假说 即局部失去了细胞壁结构或局部溶解细胞壁，使外源DNA分子能通过质膜进入细胞 。 酶受体假说 感受态细胞表面形成一种能接受DNA的酶切位点，使DNA分子能进入细胞 。 （3）转化的过程 冰冷的50m mol/lCacl2溶液 DNA分子在转化过程中将经历四个阶段 第一个是吸附阶段，完整的双链DNA分子将吸附于感受态细胞的表面 第二个为转入阶段，