乙酰化修饰定量蛋白质组学-含案例.ppt

乙酰化非标定量详细实验步骤 1：蛋白质提取 提供专业的样本制备，与后期翻译后修饰富集、液相、质谱完美对接。 注意事项： 1、样本不要反复冻融。收集后立即放于液氮中或-80°冰箱保存。 2、原始样本湿重大于1g，根据不同样本得率情况尽量多提供原始样本。 3、提得的蛋白大于5mg，可完成一次正常富集。若样本珍贵难获取，最少2mg可完成一次实验。 乙酰化非标定量详细实验步骤 2：蛋白质定量 (1) 可以采用Bradford方法及其他方法定量初步 (2) 定量取各组样本的蛋白质进行SDS电泳，考染定量，根据每个涌道染色情况微调蛋白浓度，保证后续实验中每组样本的蛋白量相同。 乙酰化非标定量详细实验步骤 3：酶切，富集 每组样本（各5mg）分别加入-20℃预冷的丙酮（丙酮：样品体积比=6：1），颠倒混匀，-20℃沉淀30min~4h 12000rpm 离心15分钟，弃上清，用lysis buffer充分混悬溶解样品； 加入还原试剂2μL，混匀，60 ℃反应1h； 加入半胱氨酸封闭试剂1μL,室温处理10分钟； 按照酶：蛋白质=1：100的比例加入trypsin酶,37℃酶解过夜（16h）； 收集肽段，纯化，真空冷冻干燥。 乙酰化抗体富集 RP分离 质谱检测 乙酰化非标定量详细实验步骤 4： 除盐，此步操作是将实验过程和相关buffer的盐除去，以便于后续分析。 （1）100%乙腈冲洗柱子3次 （2）0.1%TFA(水溶),冲洗柱子三次 （3）用400uL 0.1%TFA溶解样品，加载到柱子上 （4）0.1%TFA 冲洗柱子3~5次 （5）用50%乙腈 0.1%TFA 400μL洗脱下样品 （6）将样品冷冻干燥后进行后续分析。 乙酰化非标定量详细实验步骤 5: RP液相分离或手动RP （1）仪器及试剂： 涡旋振荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，型号：QL-901） 离心机（Thermo，型号：PICO17） RIGOL L-3000高效液相色谱系统（北京普源精电科技有限公司） 色谱柱：Durashell-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm，100 ?（Agela，货号：DC952505-0） 乙腈（Merck，货号：100030，德国） 氨水（Sigma-Aldrich，货号：17837，美国） 流动相A：98%ddH2O，2%乙腈（pH 10）- 流动相B：98%乙腈，2%ddH2O（pH 10） ddH2O用氨水调pH值到10 （2）样品用100ul流动相A溶解，14000g离心20min，取上清待用。 （3）使用酶解好的BSA标准品进行分离测试（柱温45℃，检测波长214nm），检测系统情况。取100ul准备好的样本上样。 流速0.7 ml/min，分离梯度如右图所示： （4）根据峰型和时间共收取梯度,根据规则合并，真空离心浓缩后，待质谱分析。 质谱鉴定：MS扫描范围400-1800 MS/MS扫描范围100-2000 时间（分钟） 流动相B比例（%） 0 5 5 8 35 18 62 32 64 95 68 95 72 5 乙酰化修饰详细实验步骤 6:纳升级反相色谱-Q Exactive进行蛋白质分析 （1）仪器及试剂： 涡旋振荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，型号：QL-901） 离心机（Thermo，型号：PICO17） 高效液相色谱仪：（Thermo Scientic EASY-nLC 1000 System（Nano HPLC）） 质谱系统（Thermo，型号：Q-Exactive） ? 流动相A：100% 超纯水，0.1%甲酸 流动相B：100% 乙腈，0.1%甲酸 甲酸：（Sigma-Aldrich，货号：56302，美国） 甲醇：（Sigma-Aldrich，货号：14262，美国） 预柱（Acclaim PepMap100 column，2cm x 100μm，C18，5μm） 色谱柱（EASY-Spray column，12 cm x 75 μm，C18，3μm） 进样瓶（Thermo 瓶盖（Thermo 喷针（Thermo，PN：ES542） （2）具体操作参数 时间（分钟） 流动相B比例（%） 0 4 5 15 40 25 65 35 70 95 82 95 85 4 90 4 将高pH反相分离得到的组份用20μl 2%甲醇，0.1%甲酸复溶。 12,000转离心10分钟，吸取上清上样。 上样体积10 μl，采取夹心法上样。 Loading Pump流速350nl/min，15分钟。 分离流速350nl/min，分离梯度如下： 乙酰化非标定量详细实验步