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研究基因表达的调控（一） 鉴定DNA分子上蛋白的结合位点 当某一基因的转录产物的5’端被确定后，在基因组克隆上的相应位置就是转录起始点。DNA序列的上游含有控制基因时空转录的调控序列。转录因子与特异的调控序列相结合，并有助于转录起始。 主要有两种方法： gel retardation（凝胶滞后） Footprinting with DNase I（DNase I足迹法）　　 凝胶阻滞 结合蛋白后，DNA的分子量将会增加，电泳过程中，迁移率将会下降，这种方法称为gel retardation（凝胶滞后）。可被用来检测与调控序列相结合的转录因子。 图6-22 凝胶滞后原理? Dnase I足迹法 虽然凝胶阻滞能显示出蛋白与DNA分子的结合，但它并不能提供在所用片段中结合位点的序列，DNase足迹法可确定与蛋白作用的实际序列区域。 用末端标记的DNA片段与蛋白样品(如核抽提物)相混合，待相互结合后，用DNase I酶对复合物进行温和酶解，以期产生平均一个分子被切一次的产物。 在蛋白结合区域，核酸酶不能轻易接近DNA骨架，很难实现切割。将部分酶解的DNA进行PAGE电泳分析，在对照DNA的泳道中的梯状显示出所有随机的核酸酶切割部位，而在加入蛋白样品的泳道，显示出的梯状带中会有某些带的空缺。 DNA足迹分析技术可用于RNA聚合酶(蛋白质)结合序列的确定 （二）通过deletion分析鉴定控制序列 　　凝胶滞后和足迹试验可以定位控制序列，但不能研究其功能。Deletion analysis(缺失分析)可以研究序列的功能。这种技术基于这样的原理：删除控制序列，可以改变克隆基因的表达调控方式。如基因的表达水平、组织特异性。 在删除控制区域之前必须寻找一种能检测缺失所带来的基因表达的变化，而且必须在原有生物体内这种研究才算准确，比如克隆到细菌中的植物基因必须在植物体内才能研究其调控方式。 报告基因的选择原则： 首先它控制的是寄主生物体所没有的性状； 报告基因必须容易检测； 可以定量的研究。如：lacZ, neo, cat, dhfr, aphlV, lux, uidA。 报道基因 当控制转录的基因区域(启动子)经测序、S1作图和DNA－蛋白结合实验确定后，通常要将启动子接上报道基因对其功能进行研究，以验证该启动子所具有的特性。 怎样将克隆的基因与正常表达的基因区别呢？利用一个报告基因，克隆到控制序列的下游。当克隆到寄主体内后，报告基因将模仿原有基因的表达方式，因为它们是在相同的控制序列的调控之下表达的。 图6-24 基因调控序列的结构? 　 图6-25 调控序列突变的结果 J4 克隆基因的诱变 缺失诱变 定点诱变 PCR诱变 缺失诱变 从一端开始渐渐缺失DNA对于确定特定序列的重要性是很有用的。用外切核酸酶III可从凹进的3’端沿3’向5‘方向移去一条链进行单向缺失，再用一种单链持异性核酸酶制成平末端用于连接，经转化产生出具缺失的克隆。 图6-26 调控序列突变的结果 定点诱变 仅改变一个序列中的一个或几个特定核苷酸对于验证某一假说是非常有效的。 转录因子结合位点的每一残基的重要性可通过将各残基逐个突变来检验。 对蛋白质中可能起重要作用的氨基酸可通过改变其对应的cDNA的核苷酸来改变该蛋白的组成，进而对所产生的突变蛋白进行功能分析以检测突变效果。 PCR诱变 * 在与调节蛋白结合之前，首先要将调节蛋白结合的区域进行酶切，以便观察到底是内切酶谱中的哪一个片段与蛋白结合。调控区域的精确定位依赖于内切酶谱的精细程度。一个简单的控制区域可能小于10bp，所以该种方法很难精细定位。 J 克隆DNA的分析与应用 克隆的鉴定 聚合酶链反应 J1 克隆的鉴定 克隆的鉴定：现在对克隆进行部分或全序列的测定往往是第一步。 虽然序列分析可提供推测基因的大小、限制图谱以及方向或者可读框（ORF），但仍须有实验证明推测基因确实在某生物体的一些细胞中转录成RNA，而对于那些编码蛋白的基因还要证明所预测大小的蛋白确实在体内被合成。 鉴定的内容： 鉴定前需要纯化已克隆的DNA样品 测定重组DNA分子的大小、限制图谱、基因的方向以及核苷酸的序列。 限制图谱 用一种或两种以上的限制酶对重组DNA分子进行酶解，可以构成标明该DNA分子的酶切位点和片段大小的限制图谱。 一个限制图谱代表特定限制酶识别靶位点的线性序列。限制图谱中的距离直接用碱基对(简写bp)来测量，而较长的距离用kb 表示，指DNA中1000 个碱基对或者RNA中1000个碱基。在染色体水平上，图谱用兆碱基对表示(1Mb=106bp)。 限制性图谱(Restriction map)是用限制性内切酶将DNA 切割成片段，然后测定片段之间的