酵母蔗糖酶的止提取及其性质的研究.docVIP

酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究 袁某某 （西北农林科技大学 陕西杨凌） ［摘要］采用自溶法从酵母中提取蔗糖酶，即在一定PH和适当的温度下，利用组织细胞内自身的酶系统将细胞破碎再通过乙醇的分级与透析，得到纯化的酵母蔗糖酶。本实验也通过考马斯亮蓝G250染色法，测定蔗糖酶的活力和蛋白质浓度，对蔗糖酶的性质进行了研究。 [关键词]蔗糖酶，分离提取，酶活力，蛋白质含量 1 引言 自1860年Bertholet从啤酒酵母（Sacchacomyces Cerevisiae）中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究。蔗糖酶（invertase）（β-D-呋喃果糖苷果糖水解酶）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的β-呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成蜜二糖和果糖。 2 材料与方法 2.1 实验材料 高活性干酵母粉、DEAE纤维束DE-23、0.2mol/L Tris-HCL缓冲液、牛血清蛋白、考马斯亮蓝G-250、葡萄糖、水杨酸、0.4mol/L NaOH溶液 2.2 实验方法 2.2.1 蔗糖酶的提取与部分纯化 将15g高活性干酵母粉倒入250ml烧杯中，少量多次地加入50ml蒸馏水，搅拌均匀，成糊状后加入1.5g乙酸钠、25ml乙酸乙酯，搅匀，再于35℃恒温水浴中搅拌30min。抽提补加蒸馏水30ml，搅匀，盖好，于35℃恒温过夜，8000r/min离心10min，弃沉淀及脂层，的粗级分Ⅰ。 预先将恒温水浴调到50℃，将盛有粗体级分Ⅰ的离心管稳妥地放入水浴中，不断轻摇离心管保存30min。取出离心管，于并于中迅速冷却，4℃，10000r/min, 离心10min。取上清液，量出体积，留出1.5ml测定酶活力及蛋白质含量（称为热级分Ⅱ）。 将热级分Ⅱ转入小烧杯中，放入冰盐浴，逐滴加入等体积预冷至-20℃的95%乙醇，同时轻轻搅拌30min，再冰盐浴10min，以沉淀完全。4℃，10000r/min, 离心10min，弃去上清液，并滴干，沉淀保存于离心管中，盖上盖子，然后将其放入冰箱中冷冻保存，即醇级分Ⅲ。 2.2.2 酶活性及酶活力影响因素的研究 采用水杨酸试剂显色法，通过测定反应后样品中还原糖的量来确定酶活力。 标准曲线的制作 取做好编号的试管，按下表进行实验。 管号 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 20mmol/L葡萄糖/ml 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 葡萄糖/μmol 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 /ml 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 水杨酸试剂/ml 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 沸水浴5min，流水冷却，定容至15ml 0 0.102 0.161 0.215 0.262 0.333 0.353 0.385 0.412 0.440 0.479 反应时间的影响 取做好编号的试管，按下表进行实验。 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0.2mol/L蔗糖/ml 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 乙酸缓冲液pH5.0/ml 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 /ml 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.6 0.4mol/L NaOH/ml 1.0 由加酶开始计时 蔗糖酶/ml 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 反应时间/min 0 1 3 6 10 15 20 30 40 50 反应时间到后立即向2~10管加入1ml 0.4mol/L NaOH终止反应。并向各管加入2ml 3,5-二硝基水杨酸，沸水浴准确煮5min后，迅速流水冷却，用水定容至15ml 0.116 0.187 0.314 0.394 0.323 0.717 0.832 1.004 1.329 0.016 生成还原糖μmol/ml 0.162 0.373 0.751 0.989 0.778 1.950 2.292 2.803 3.770 pH值的影响 取做好编号的试管，按下表进行实验。 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 0.2mol/L蔗糖/ml 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 乙酸缓冲液pH 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 pH梯度/ml 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 /ml 0.8 0.2 0.4mol/L NaOH/ml 1.0