低盐胁迫下三疣梭子蟹蝗抗利尿肽基因的表达分析1摘要本研究采用.DOC

PAGE \* MERGEFORMAT1 低盐胁迫下三疣梭子蟹蝗抗利尿肽基因的表达分析收稿日期： 收稿日期：2017-11-09；修订日期： 基金项目：国家虾蟹产业技术体系（CARS-48）；泰山领军人才工程高效生态农业创新类计划（LJNY2015002）；国家自然科学基金面上项目41506186）；海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室开放课题（2016LMFS-A12）；江苏省水产三新工程项目（Y2015-3） 作者简介：孙东方（1991—），男，硕士研究生；主要从事三疣梭子蟹遗传育种工作；Email：HYPERLINK mailto:961012207@961012207@ 通信作者：刘萍，研究员；E-mail：liuping@. 摘要：本研究采用RACE技术克隆了三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）蝗抗利尿肽（neuroparsin）基因。该基因全长1920 bp，5’端非编码区237 bp，3’端非编码区1373 bp，开放阅读框309 bp，编码102个氨基酸，预测分子量10.8 kDa，理论等电点7.42。PtNP含有12个半胱氨酸残基，具十足目动物蝗抗利尿肽典型的特征。同源性和系统进化分析表明，PtNP与拟穴青蟹（Scylla paramamosain ）NP4的同源性最高（89%），并且三疣梭子蟹与拟穴青蟹首先聚为一支。组织表达分析发现，PtNP基因在脑组织中的相对表达量最高，其次是鳃和眼柄，在卵巢、肌肉、心脏和肝胰腺中表达量较低或不表达。通过分析PtNP基因在低盐胁迫过程中的表达规律发现，低盐胁迫可显著改变PtNP基因在脑、鳃和眼柄组织中的表达模式，整体呈上调表达趋势，其中在脑、鳃和眼柄中表达量分别最高上调至7.7倍、2.8倍和2.6倍，且存在显著差异（P0.05）。去除眼柄后该基因在鳃中的表达成上升趋势，且去除双侧眼柄组的表达量显著高于去除单侧眼柄组（P0.05）。本研究结果表明PtNP基因在三疣梭子蟹盐度适应中可能发挥一定作用且受神经内分泌系统的调控。 关键词：三疣梭子蟹；蝗抗利尿肽；基因克隆；盐度胁迫；去除眼柄；表达分析 三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）属于甲壳纲Crustacea、十足目Decapoda、梭子蟹科Portunidae，是一种重要的海洋经济动物[1]，在我国分布广泛。三疣梭子蟹可存活于盐度为13.7-47.7的环境中，属广盐性水生甲壳动物，具有生殖洄游习性，常在港湾或河口低盐区排幼[2]，深海高盐区越冬。盐度成为影响三疣梭子蟹生长发育至关重要的环境因子之一，对其摄食、蜕皮、生长、代谢、免疫等具有重要作用[3]。耐盐性状，尤其是耐低盐性状是三疣梭子蟹重要的育种性状。在我国北方，三疣梭子蟹多以室内育苗、室外养殖为主，生长周期较长。夏季由于暴雨多发，养殖海水盐度急剧下降，使得三疣梭子蟹体内渗透压失衡，导致其生长缓慢，疾病暴发。因此，开展盐度适应机制研究对三疣梭子蟹耐盐良种的培育具有重要意义。 渗透压调节是甲壳动物进行盐度适应的重要生理活动，有证据显示渗透压调节受神经内分泌系统调控，其中神经肽在该过程中发挥了重要作用[4]。甲壳动物神经肽由甲壳动物中枢神经系统分泌，通过自分泌、旁分泌和内分泌的方式直接或间接的作用于靶器官，对甲壳动物的新陈代谢、渗透压调节和激素的合成与释放起着至关重要的作用[5, 6]。目前，三疣梭子蟹盐度相关研究主要集中在盐度对个体发育[7]、生长代谢[8]、酶活[9]等的影响及盐度相关基因的克隆与表达分析[10-12]，涉及神经肽在渗透压调节方面的分子机理研究较少。 蝗抗利尿肽（neuroparsin，NP）是一类分子量为8 kDa的小分子神经内分泌多肽，该基因编码97-106个氨基酸，预测信号肽为25-29个氨基酸，成熟肽为72-77个氨基酸。蝗抗利尿肽类似于脊椎动物胰岛素生长因子结合蛋白N端结构域[13]，可能与内源性的胰岛素样相关肽相结合，胰岛素相关肽信号通路与生长发育有重要关系[14]。在昆虫的研究中，蝗抗利尿肽最初从东亚飞蝗（Locusta migratoria）的脑部神经内分泌细胞中分离[15]，随后在沙漠蝗（Schistocerca gregaria）中也分离出蝗抗利尿肽，并且指出该神经肽对卵黄生成具有抑制作用[13]。在昆虫的发育、蜕皮和生殖时期，蝗抗利尿肽基因的转录水平发生改变，推测该肽可能与生殖和发育有关[16]。Boureme等[17]证明蝗抗利尿肽类似肽（Neuroparsin-like peptides ，NPLP）具有刺激蟑螂（Blaberus craniifer）和非洲蝗虫（Locusta migratoria migratorioide）的肠道对水分重吸收的作用。