第35章dn学a的重组.docVIP

第三十五章 DNA 的重组 第一节 同源重组 一、Holliday 模型 二、细菌的基因转移与重组 致育因子（F 因子）通过结合作用由F+细胞向F-细胞转移，F 质粒约1/3 的基因与转移有关，traS 和traT 基因编码表面排斥蛋白，阻止F+细胞之间的转移，F+细胞的性菌毛与F-细胞结合后收缩，使二者靠近，TraD 蛋白构成转移的通道，在TraI 在TraY 的帮助下结合到转移起点oriT 上，切开一条链，使其5′端进入受体细胞，并合成其互补链，使F-细胞转化为F+细胞，给体细胞中的单链也可以合成互补链。 在细菌基因转移的不同时间将配对细胞分开，可以确定基因在染色体上的位置。F 质粒DNA 可以通过重组整合到受体的染色体中，使受体菌成为高频重组（Hrf）菌株，若F 质粒的DNA 未能完整地进入受体菌，则受体菌不能转化为F+，F 质粒的DNA 可以被切割出来，有时可携带宿主菌的染色体DNA，称作F′因子，F′因子携带的基因可在受体菌表达。 外源基因可以进入感受态细菌，称作转化，自然条件下感受态的形成需要10 多种蛋白质参与，实验室常用高浓度的Ca2+处理使细菌形成感受态。 通过噬菌体将细菌基因从供体菌转移到受体菌称作转导，若宿主菌任意部位的基因取代噬菌体DNA的一部分转入受体菌，称作普遍性转导，若宿主整合部位的DNA 取代了噬菌体的部分DNA 称作限制性转导。进入受体菌的基因可与染色体重组。 用溶菌酶除去细菌的细胞壁，人工促使原生质体融合，可引起广泛的重组。 大肠杆菌染色体的基因图 噬菌体的基因重组 三、重组有关的酶 依赖RecBCD 起始的重组模型： RecBCD 有依赖ATP 的核酸外切酶、核酸内切酶和解螺旋酶活性，当DNA 断裂时，它结合在其游离端，使其解旋并降解，直至酶移动到chi 位点（GCTGGTGG），在其3＇侧4-6 核苷酸处将链切断，产生3＇游离单链，随后单链与RecA 结合，开始同源区重组。 RecA 蛋白的丝状聚合体与DNA 的相互作用 RecA 蛋白的带状图解 RecA 蛋白的丝状聚合体，每一圈螺旋由6 个RecA 蛋白单体构成，其中一个单体由红色标出。 RecA 蛋白引起DNA 同源重组的模型 在大肠杆菌中由RuvA，RuvB 和RuvC 蛋白参与的同源重组。 （a）RuvA 四聚体的图解。四个亚基形成的结构像四个花瓣的花。 （b）RuvA/RuvB 的作用： （左）RuvA 四聚体结合到Holliday 位点； （中）RuvB 六聚体结合到杂合双螺旋的两对面，DNA 穿过其中心， RuvB 六聚体的作用像马达，促进超螺旋分叉点通过复合体移动。 （右）RuvC 结合到Holliday 位点，由其核酸酶活性切断核酸链，切割位点由剪切体辨认。 （c）RuvA 四聚体的电荷分布，蓝色表示正电荷，红色表示负电荷，注意正电荷位于四聚体的表面，有四个负电荷区域位于其中心。 （d）假设的RuvA 四聚体与Holliday 位点结合的结构模型。 第二节 特异位点重组 细菌的特异位点重组 沙门氏菌两种鞭毛蛋白表达的调控 免疫球蛋白基因的重组 IgG 的分子结构 重组位点有7 和9nt 的信号序列，中间间隔12 或23bp。 免疫球蛋白基因重组的模型 重组酶（RAC1/RAC2）复合体与重组信号序列结合。 复合体使编码序列与重组信号序列之间的双连断裂，编码序列的末端形成发夹结构。 重组信号序列结合形成环状结构。 编码序列连接前经过加工，连接位点不十分确定，增加了免疫球蛋白的多样性。 DNA 依赖性蛋白激酶（DNA-PK）和DNA 连接酶参与了加工和连接过程。 在不同的核苷酸位点重组可以生成不同的蛋白质。 第三节 转座重组 一、细菌的转座因子 插入因子转座子具有反向末端重复序列以及在靶部位两侧产生的同向重复序列。在该例中靶序列为5bp，转座子末端由9bp 反向重复序列组成，数字1-9 指序列重复碱基对。 组合型转座子：两个插入序列之间夹着一段序列（可以是某个基因，如抗性基因）。两个插入序列可以同向或反向排列，有时均有转座活性，有时只有一个有转座活性。 复合型转座子：插入序列被转座酶基因取代，图示为Tn3（TnA 家族）的结构。两端为38bp 的反向重复，其两侧为5bp 的靶序列，tnpA 编码转座酶，tnpR 编码的蛋白质可以作为解离酶（使转座子与受体DNA 形成的共整合体重组和解离），也可以作为阻遏蛋白调节tnpA 和tnpR 两个基因的表达，res 为解离的控制位点，TnpR 蛋白结合于其上发挥调控作用。 转座的方式 转座子可用不同的方式转座，转座因子插入基因后可使基因失活，也可引起染色体的断裂、重复、缺失、倒位、易位等变化。 两个IS10 组件构成一个复合转座子，它能使位于他们之间的任何DNA 易位。当Tn10 是