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PAGE PAGE 1 第5章 遗传图谱 遗传图谱是应用遗传学技术构建能显示基因以及其它序列特征在基因组上的位置的图。遗传学技术包括杂交育种实验、人类家族的系谱分析。 1 遗传图谱的标记 1.1 基因 基因是首先被使用的标记。最初的遗传图谱是在20世纪初对果蝇等生物构建的，使用基因作为标记。一个遗传性状必须以两种替换形式或表型存在才能用于遗传学分析。如孟德尔首先研究的豌豆茎的高或矮。每种表型是由相应基因的不同等位基因所决定的。起初只有那些能通过视觉区分的基因表型能用于研究。比如，第一张果蝇遗传图显示了负责身体颜色、眼睛颜色、翅膀形态等基因的位置，这些表型都可在低倍显微镜下或肉眼观察果蝇而看到。早期觉得这种方法很精确，但遗传学家们很快发现，只有有限的几种可见表型的遗传可用于研究，而在许多情况下，由于不止一个基因影响一个物理特征，分析起来并不太容易。例如，到1922年，有超过50个基因被定位在4条果蝇染色体上，而其中9个基因负责眼睛的颜色，想在此领域有所贡献的每一个初涉者必须首先学会辨别果蝇眼睛的颜色是红、淡红、朱红、石榴石红、康乃馨色、肉桂色、深褐色、猩红色或深红色。为了使基因图更加全面，有必要找到一些比可见的性状更多、更明确而且更简单的性状。 解决的方法是应用生物化学方法区分表型。这对于微生物与人类尤为重要。细菌与酵母只有为数很少的可见性状，因此这类生物的基因作图只能依赖于生化表型。人类以血液分型为代表的生化标记研究从20世纪20年代就开始了。血液分型研究不仅包括如ABO系统的标准血型，还有血清蛋白以及人类白细胞抗原（HLA系统）等免疫蛋白的等位基因可变体。这些标记相对于可见表型的一个巨大优点是其相关基因往往为复等位基因。HLA-DRB1基因至少有59个等位基因，而HLA-B至少有60个。这正是与人类基因作图相关的。与在果蝇或小鼠等生物中建立的杂交实验不同，人类基因遗传的数据只能通过检查一个家族中各成员的表型来获得。如果对所研究的基因而言，所有的家族成员都为纯合子，就得不到有用的信息。这对于只有两个等位基因的基因较为常见。因为婚配偶然地发生于同一个等位基因纯合子个体之间。而当所研究的基因有60个而不是2个等位基因时，这就很少见了。 1.2 DNA标记 基因是非常有用的标记，但绝不是理想的。特别是对于像脊椎动物及开花植物的较大基因组来说，仅依赖基因作出的图不够精细。即使是每个基因都在图上定位，情况依然如此，这是因为在这些生物的基因组中，基因散在分布而且它们中间有大的间隙，此外基因中仅有一部分以比较容易区分的等位形式存在，从而使这一问题更为严重。因此遗传图谱就不够全面。故我们需要其它类型的标记。 除基因外用于作图的DNA特征称为DNA标记（DNA marker）。与基因标记一样，DNA标记必须有至少两种等位形式。有三种序列特征满足此要求： 1.2.1限制性酶切片段长度多态性（RFLP） RFLP（restriction fragment length polymorphism）是第一种用于研究的DNA标记。 ①限制性内切酶 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）是结合在DNA分子的特定序列上，并在识别序列或其附近将双链DNA分子切开的酶。限制性内切酶有三种： = 1 \* ROMAN I类和 = 3 \* ROMAN III类的切割位点和识别序列不存在严格的关系，而Ⅱ类限制性内切酶则在识别序列或非常接近的位置进行切割。用限制酶处理一个DNA分子时，即产生限制片段。如Ⅱ类限制酶EcoRⅠ(从大肠杆菌中分离得到)只在6核苷酸5’-G∣AATTC-3’处切割。这种序列特异性意味着用一种限制酶处理一种DNA分子总会产生同样的片段。但对于基因组DNA来说，并不总是这样。这是因为有些限制位点具多态性，以两种等位形式存在。一种等位形式有正确的限制位点序列，能被酶切开；另一等位形式的序列有改变，从而该限制位点不能被识别。后者的结果使在限制性核酸内切酶处理后，两个相邻的限制片段仍然连接在一起，从而导致了多态性。现在已分离到2500种以上的Ⅱ类限制性内切酶，其中有300多种已在实验室种使用。人类基因组中大约有105个RFLP。 ②限制性片段长度多态性的检测 为了量化RFLP，有必要在很多不相关片段的背景中判定一个或两个限制片段的长度。这不是一个小问题，核酸内切酶如的识别序列长6bp，那么大约每46（＝4096bp）能切割DNA一次，因此如果切割人基因组DNA，可产生近750 000个片段。所以必须采用一定技术检测特定的限制片段。目前检测RFLP的方法主要有Southern杂交和PCR。 Southern杂交(Southern hybridization) 它是用于对RFLP的第一种技术，限制性内切核酸酶酶切