匙吻鲟雌核发育诱导及其相关机制研究-渔业资源专业论文.docxVIP

匙吻鲟雌核发育诱导及其相关机制研究摘要 匙吻鲟雌核发育诱导及其相关机制研究 摘要 匙吻鲟(尸D咖如刀置阳珈材幼隶属鲟形目(Acipenserif0】衄es)、白鲟科 (P01yodo埘dae)、匙吻鲟属(凡咖如刀)， 是美国特有的大型淡水经济鱼类，也是 世界上现有的白鲟科鱼类之一，与我国白鲟是同科异属的珍稀动物。匙吻鲟具有 生长快、品质优、适应性广、抗逆能力强等特点，且肉质细腻、营养丰富，是公 认的优良养殖鱼类。我国于20世纪90年代初从美国引进匙吻鲟受精卵进行人工 孵化并试养成功，目前匙吻鲟已成为我国水产养殖业广受欢迎的一个名优新品 种。 由于匙吻鲟与白鲟(风印JjI“嬲鲥锄淞)同属于白鲟科，因此开展匙吻鲟雌核发 育的人工诱导实验可为长江白鲟的种群恢复奠定技术基础。此外，近几年随着匙 吻鲟养殖产业的形成，国内每年可人工繁殖的匙吻鲟苗种达数百万尾，获得抗病 强，生长快等优良性状的匙吻鲟品系是育种工作的首要任务。 人工诱导雌核发育技术是快速建立其纯系，选育优良品种的有效途径，为此 本研究以我国人工养殖的匙吻鲟为研究对象，采用施氏鲟(么c勿g凇P，．sc^，．绷c枷) 精子诱导匙吻鲟雌核发育二倍体，通过形态学、细胞遗传学方法与微卫星分子标 记对雌核发育群体进行了鉴定，同时，采用扫描电镜、透射电镜和慧星实验对紫 外线照射的精子的超微结构和核DNA损伤程度进行了研究，最后，对雌核发育 匙吻鲟受精细胞学及其性别决定机制进行初步的探讨，主要研究结果如下： 1．在以匙吻鲟为母本，施氏鲟为父本的杂交试验中发现，杂交胚胎能发育 到原肠期，但无孵出存活，胚胎在出膜前因发育畸形而死亡，经胚胎染色体计数 分析表明其染色体为n-为0，从而确定，施氏鲟精子与匙吻鲟卵子杂交所得后代 即为匙吻鲟的单倍体。基于这个研究结果，本研究首次采用施氏鲟鲜精作为诱导 匙吻鲟雌核发育的激活源，通过对雌核发育热休克起始时间，热休克温度和热休 克持续时间的筛选和优化，确定了利用施氏鲟鲜精诱导匙吻鲟卵雌核发育的最佳 条件是：在18℃水温中授精18 nlin后，用37℃的淡水对卵进行热休克处理2 min。 该组受精率为76．4士9．2％，胚胎孵化率为7．8士1．4％。本研究同时筛选出了施氏 鲟精子遗传失活的条件，即采用波长为254 nm的紫外线照射(照射强度为863 酬cm2)5 min能使施氏鲟精子遗传失活。采用遗传失活的施氏鲟精子与匙吻鲟 华中农业大学201 华中农业大学201 1届博士研究生学位论文 卵授精后热休克的方法诱导匙吻鲟雌核发育，该组受精率为56．4士1．2％，胚胎孵 化率为28．7士1．8％。 在雌核发育后代鉴定的实验中，分别采用了形态学、染色体计数和核型分析、 流式细胞仪检测DNA含量和微卫星标记技术对雌核发育鱼苗进行了鉴定。 结 果发现，对照组匙吻鲟和雌核发育匙吻鲟在形态上没有差异，对照组和雌核发育 组匙吻鲟的染色体组均由80条基本染色体和40条微型染色体组成。根据Lev锄， et a1的分类标准，对匙吻鲟10个中期分裂相进行放大测定，按染色体臂比及相 对长度把匙吻鲟染色体分为3组：中部着丝点粒染色体(mW条、亚中部着丝粒 染色体(sm)32条、亚端部着丝粒染色体(st)和端部着丝粒染色体(t)44条。染色体 臂数(1师)为196，其核型公式为44m+32sm+44st，t。对对照组二倍体血液样品和 雌核发育匙吻鲟血液样品进行DNA相对含量的检测，雌核发育匙吻鲟红细胞的 DNA含量与二倍体匙吻鲟红细胞DNA含量比为1：l，其相对含量在3．50．3．59 pg。 2．采用扫描电镜和透射电镜观察了经紫外线辐射前后施氏鲟精子形态结构 和超微结构的变化。结果表明，成熟的施氏鲟精子由顶体、细胞核、中段和尾部 三部分构成，其平均长度(顶体+细胞核+中段)为8．95岬1，加上尾长(36．80“m)共 约45．75岬1。鲜精具有明显的顶体及后外侧延伸物，顶体中含有亚顶体、顶体泡 和顶体腔，顶体腔中有少量颗粒状物质。经紫外线照射后，精子表现出顶体不明 显或顶体与核发生糅合，后外侧延伸物消失或变短，顶体膜受损，顶体腔增大， 颗粒物质丢失，有的精子甚至顶体脱落；顶体泡、亚项体与核之间的排列松弛， 线粒体内嵴弥散或线粒体脱落。可以推断，紫外线照射对精子膜、顶体、线粒体 和鞭毛的损伤可能是造成精子活力和受精率降低的原因。 为了更好地了解紫外线辐射与精核DNA相互作用的机理，本文首次采用慧 星实验探明了紫外线照射对精子DNA完整性的影响。实验结果表明：随着Uv 照射剂量的增加，施氏鲟精核DNA断片增多，慧星状细胞数和慧尾长度也增加。 紫外线照射时间大于5 min时，精子的彗星率、损伤系数与鲜精差异显著 (PO．05)。紫外线照射剂量与出现彗尾的频率及长度呈明显剂量．效应关系。