质粒dna的抽提等、纯化与检测.ppt

实验 提取质粒DNA的目的与意义 基因载体/基因克隆/基因工程： 在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。 提取方法概述 原理示意图 重组质粒的酶切反应 核酸电泳 核酸分子是两性解离分子，在pH8.0～pH8.5时，磷酸全部解离，使得核酸分子带负电荷，向电场正极移动。 质粒的三种构型 重组质粒双酶切电泳 点样： 小结 1．质粒的提取：碱裂解法分离纯化质粒DNA，利用质粒 DNA与染色质DNA变性与复性的差异。 2．质粒的酶切：限制性核酸内切酶可以识别特异 的DNA序 列，并切割双链DNA。本实验中EcoR I、Hind III将3.4 Kb的质粒双酶切为2.5 Kb和0.9Kb的两个片段。 3．电泳分析：利用不同的分子量的DNA片段在琼脂糖凝胶 中泳动速度不一样使其分离。 思考题 1. 碱裂解法分离纯化质粒DNA基本原理是什么？结合基本原 理分别讲述溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ发挥怎样的作用。 2. 实验操作中应注意哪些步骤？否则可能产生怎样的后果？ 3. 如何通过电泳分析判断得到的质粒DNA的质量？ 4. 如果质粒DNA中残留有蛋白质或RNA，电泳后会出现什么结 果？ * * 分子生物学实验（综合性） 质粒DNA的抽提、酶切及电泳鉴定 常规PCR技术 感受态细胞的制备及重组质粒的转化 真核细胞基因组DNA的分离、纯化与检测 质粒DNA的抽提、酶切及 电泳鉴定 实验安排 上午：质粒DNA 的提取与纯化 中午：质粒DNA 的酶切 下午：电泳鉴定 质粒(plasmid)：是细菌、酵母菌和放线菌中自然存在的独立于染色体外、具有复制能力的小分子共价闭合环状双链DNA。 现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因。 是重组DNA技术中重要的载体。 质粒 作为载体的质粒： 多克隆位点 选择标记 容纳较大的外源DNA 质粒的特性： 相对独立性 独立的复制单位 赋予宿主细胞一些表型 与宿主菌染色体DNA不同 质粒 如何获得批量的纯化质粒DNA分子？ （一）载体的制备 ： 质粒DNA的提取与纯化 基本步骤 培养细菌使质粒扩增 收集和裂解细菌 分离、纯化质粒 常用方法 碱裂解法 煮沸裂解 试剂盒法 氯化铯密度梯度离心法 碱裂解法分离纯化质粒DNA 基本原理：利用质粒DNA与染色质DNA变性与复性的 差异。 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性；当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 溶液Ⅰ： 50mmol/L葡萄糖, （pH8.0 ） 10mmol/L EDTA ， 25mmol/L Tris-HCl 溶液Ⅱ： 0.2mmol/L NaOH, 1% SDS 溶液Ⅲ： pH4.8, [K+]=3mol/L, （pH4.8 ） [Ac-]=5mol/L 重悬细菌；保护和缓冲作用 裂解细菌 蛋白、DNA变性 中和NaOH 质粒DNA复性 染色质DNA、蛋白不能复性 重要试剂 碱裂解法提取质粒的流程 离心收集菌体 溶液III中和 溶液I充分重悬 溶液II裂解 上清液 抽提 离心洗涤 酒精沉淀 干燥溶解 沉淀 质粒DNA溶液 1. 取1mL菌液于1.5mL离心管中，10000rpm离心1min，弃上清。 2. 将细菌沉淀悬浮于100μL冰预冷的 溶液I 中，振荡混匀。 3. 加200μL新鲜配制的溶液II，盖紧管盖，上下轻柔颠倒离心管混匀5次（勿强烈振荡），冰上放置2min。 4. 加入150μL预冷的溶液III，将管轻柔上下颠倒数次（6-8次）混匀，见白色絮状沉淀，冰上放置3min。 碱裂解法提取质粒操作步骤 步骤1中可用移液枪将残留液体吸取，勿吸到沉淀。 步骤2中应充分悬浮，使细胞分散混匀。 步骤3、4中切记动作轻柔，应缓慢上下颠倒离心管混 匀 ，勿强烈振荡，否则质粒容易断裂。 菌液：E coli JM109菌株(含pUC19-X基因重组质粒) 5. 12000rpm离心5min，小心吸取上清至干净的1.5mL离心管中。 6. 加等体积（约450μL）酚:氯仿，混匀，12000rpm离心5min，取上清移至另一1.5mL离心管中。 7. 加1mL冰预冷无水乙醇，上下颠倒混匀几次，室温放置10min；12000