蛋白质组学中高灵敏度高特异性的生物质谱新方法研究-分析化学专业论文.pdf.docxVIP

复旦大学博士学位论文摘要 复旦大学博士学位论文 摘要 本论文针对目前蛋白质组学研究中的热点问题，将纳米无机材料、介孔无机 材料、材料表面官能化与多肽化学修饰的方法结合起来，开展了一系列的研究工 作。发展了一系列针对小分子化合物、磷酸化修饰蛋白质与糖基化修饰蛋白质的 新技术与新方法，并进行了应用型研究，取得了一些创新性成果。本论文主要发 展了适用于小分子及糖类的新型MALDI无机基质：针对磷酸化修饰，将化学衍 生技术应用于多肽羧基，大幅度提高了磷酸化多肽的离子化效率；还将硼酸基团 修饰的无机介孔材料应用与糖基化多肽的富集，并随后发展出了糖基化多肽的靶 上富集技术。主要研究内容和取得的主要研究成果摘要如下： 第一章概述了蛋白质组学的发展现状，简要介绍了蛋白质组学研究中最重要 的几项技术及其在当今生物科学研究中的地位和作用。阐述了激光解吸离子源质 谱(Matrix．assisted laser desorpfion／ionization mass spectrometer，MALDI．MS)在蛋 白质组学中应用的现状与主要困难。介绍了MALDI基质在整个离子化过程中的 重要作用并概述了MALDI基质的发展历程与面临的主要困难。对蛋白质翻译后 修饰中最为重要的两类(磷酸化与糖基化)后修饰的生物学意义以及主要研究方 法进行了综述。在此基础上，提出了本论文选题的目的和意义。主要内容和主要 成果将在以下几章的摘要中逐一简述。 第二章针对常规有机MALDI基质容易产生大量低分子量端噪音的问题，将 柠檬酸氢铵参杂的纳米二氧化钛作为MALDI基质，用于分析小分子化合物与糖 类。本章介绍了无机MALDI基质的概况与发展该新型基质的意义。详细阐述了 该新型无机基质的制备与使用方法。与传统有机基质CHCA相比，该氧化钛基 质具有下列几个优点：首先，纳米氧化钛成本极低，远低于常用有机基质的价格。 而且基质制备方法简单，无需复杂处理；其次，氧化钛基质本身不电离，只有参 杂的柠檬酸氢铵会产生两个碱金属加和峰，很容易辨识。因而大大简化了低分子 量端的质谱图，适用于分析小分子；第三，可以分析糖类等通常难以被IVIALDI 质谱检测的化合物；第四，样品分布均匀，重现性好，可以对样品进行定量分析； 最后，对小分子具有很高的灵敏度，例如对蔗糖和D环糊精可以达到纳摩尔级的 检测限。试验结果表明，柠檬酸氢铵参杂的纳米氧化钛基质成功地实现了对分子 量1200以内的小分子的定性与定量分析。 第三章针对磷酸化修饰的多肽离子化效率低、容易受到非磷酸化多肽的压制 导致难以被质谱检测的问题，发展了使用1．(2．嘧啶基)哌嗪 (1．(2．pyfimidyl)piperazine，PP)来修饰多肽羧基，从而实现大幅度提高磷酸化多 肽的离子化效率并显著减弱非磷酸化多肽的压制效应的目的。本章概述了蛋白质 复旦大学博士学位论文磷酸化的重要生物学意义，介绍了磷酸化研究的主要方法与现状，并阐述了发展 复旦大学博士学位论文 磷酸化的重要生物学意义，介绍了磷酸化研究的主要方法与现状，并阐述了发展 该方法的重要意义。采用l一(2一嘧啶基)哌嗪(1一(2一pyrimidyl)piperazine，PP)修饰多 肽羧基可以增加多肽的等电点、气象碱性度和疏水性，从而提高多肽在MALDI 源与ESI源中的离子化效率。尽管本方法无差别地修饰所有多肽中含有的所有羧 基，但是磷酸化多肽经PP羧基衍生后离子化效率提高的倍数远大于非磷酸化多 肽。因此，在混合体系中难以直接检测的磷酸化多肽经过PP羧基衍生后信号强 度相比于非磷酸化多肽显著增强，从而实现了不需要经过质谱前磷酸化多肽特异 性预富集而使磷酸化多肽得到检测的目的。与传统方法相比，本方法消耗更少的 样品量和更少的时间，同时避免了传统化学修饰方法产率低、反应条件苛刻和副 反应多的问题。 第四章针对糖基化后修饰研究中糖基化多肽含量低、结构复杂、离子化效率 较低并且现有富集方法综合性能不高的问题，发展了一种基于硼酸官能化的介孔 二氧化硅材料的特异性富集方法，从而显著改善了糖基化多肽质谱预富集方法效 率不高、适用性不广的问题。本章概述了糖基化研究的重要性及其面临的主要困 难，介绍了现有的特异性富集糖基化修饰的方法，并阐述了发展该新型富集方法 的目的与意义。由于硼酸可以与顺式二羟基形成共价键(醚键)从而成为五元环。 因而这一反应具有广泛的适用性：无论是来自N．糖或0．糖还是任意糖型的顺式 二羟基都可以与硼酸发生化学反应并成键。根据这一原理，我们将硼酸作为表面 官能团嫁接于载体表面，使其具有捕获糖基化多肽的能力；同时，我们选择具有 高比表面积的介孔二氧化硅作为载体，以期实现对糖基化多肽的高特异性富集。 本章介绍了硼酸修饰的介孔二氧化硅的结构特征与合成方法，对其结构进行了严 谨的