一种新型硫酸软骨素ac外切酶的基因克隆及其催化特性条研究-药学专业毕业论文.docx

山东大学硕士学位论文2．2．2设计简并引物扩增部分目的基因 山东大学硕士学位论文 2．2．2设计简并引物扩增部分目的基因 15 2．2．3利用反向PCR扩增下游基因序列 ．．16 2．2．4应用Genome walking技术克隆剩余基因序列 17 2．2．5扩增全部目的基因 1 9 2．3实验结果 19 2．3．1中间部分目的基因的扩增 20 2．3．2下游目的基因的扩增 2l 2．3．3上游目的基因的扩增 22 2．3．4克隆全部目的基因 22 2．4讨论 。24 第三章新型硫酸软骨素降解酶的异源表达及性质研究 26 3．1实验仪器、材料与试剂 26 3．1．1仪器 26 3．1．2试剂 ．26 3．2实验方法 27 3．2．1目的基因的制备 27 3．2．2重组表达载体的构建 27 3．2．3重组蛋白的表达 29 3．2．4重组蛋白的纯化 29 3．2．5重组蛋白的活性验证 3l 3．2．6重组蛋白的性质研究 3 1 3．3实验结果 33 3．3．1重组表达载体的构建 33 3．3．2重组蛋白的表达与纯化 35 3．3．3重组蛋白的活性验证 35 3．3．4重组蛋白的性质研究 37 3．4{寸论 ．．40 3．4．1基因工程菌的构建与筛选 40 万方数据 山东大学硕士学位论文3．4．2重组蛋白的表达与纯化 山东大学硕士学位论文 3．4．2重组蛋白的表达与纯化 41 3．4．3 AsChnAC底物适应性的分析及酶学性质研究 42 第四章催化方向的研究 43 4．1实验仪器、材料与试剂 43 4．1．1仪器 ．．43 4．1．2试剂 43 4．2实验方法 43 4．2．1模式底物合成 43 4．2．2模式寡糖底物的降解 45 4．3实验结果 45 4．3．1三糖底物合成 45 4．3．2 AsChnAC降解三糖产物分析 47 4．3．3 HP．CS．六糖合成及AsChnAC降解六糖底物分析 ．．48 4．3．4 CS．HP．六糖合成及AsChnAC降解六糖底物分析 ．．5 l 4．3．5总结 53 4．4讨论 ．．5t； 总结 ．58 参考文献 6l 至|【谢 ．66 攻读硕士期间发表的论文 67 附录 ．68 附录1目的基因AsChnAC序列 68 附录2 AsChnAC氨基酸残基序列 ．70 万方数据 山东大学硕士学位论文Abstracts 山东大学硕士学位论文 Abstracts in Chinese 1 Abstracts in English ．3 Symbolic description 5 CHAPTERl Introduction 7 1．1 chondroitin sulfate ．．7 1．1．1 Glycosaminoglycans ．．． 7 1．1．2 Chondroitin sulfate ． ． ．8 1．1．3 Pharmacological activity ofchondroitin sulfate ． ．． ．8 1．2 Chondroitin sulfate lyase ．8 1．2．1 Glycosaminoglycans lyase 8 1．2．2 Classification ofCS ．．9 1．2．3 Chondroitin sulfate AC lyase．．．．．．．．． ．．．．． ．．．．．．．．．． ．． ．．．． ． ．． ．．． ．．9 1．2．4 Application ofChSase．． ．．．． ．．．． ． ．． ．．．． ．．．．． ． ．．．．．．．．． ．．． ．．． ．．．．．．10 1．2．5 Gene cloning and recombinant expression ofChSase．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1 1 1．3 The research content and significance ．11 1．：；．1 Amplification ofunknown gene sequence． ．． ．．．． ．． ． ．． ． ．．． 1 1 I．3．2 Hetemlogous expression and purification ofChSase．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． ．．．．．．12 1．3．3 Catalytic direction ofChnAC ．．．．．． ． ． ．．．．12 1．3．4 Research significance．． ．．．．． ．．． ．．． ．．．．． ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． ． ．．． 1 3 CHAPTER2 Amplific