乙醛脱氢酶2aldh2调控线粒体自噬抵抗心肌缺血再灌注官损伤的机你制研究.docx

山东大学博士学位论文 山东大学博士学位论文 CATALOGUE Abstract in Chinese ’1 Abstract in English 一7 Abbreviations ’13 Paper 15 Instruction ’15 Materials and Methods ·。19 Results 39 Discussion 。： ‘45 Innovation and Limatation ’49 Conclusion 50 Figures ·‘51 References ’66 Acknowledgement ·· · _···_ ‘ ‘68 List of my publications ’69 Comment and debate of thesis ‘99 万方数据 山东大学博士学位论文中文摘要 山东大学博士学位论文 中文摘要 研究背景 心肌缺血再灌注(i schaemia／reperfusion，I／R)损伤，是指心脏冠状动 脉被阻断一定时间后，恢复血流再灌注的缺血心肌出现结构和功能的损伤，导致 梗死范围进一步扩大，心脏功能进一步损害。I／R损伤是冠心病领域多年来研究 的重点与热点。研究已经证实，氧化应激是导致心肌缺血／再灌注后心肌损伤的 重要原因。目前心肌缺血再灌注损伤的主要保护措施包括：缺血预处理、缺血后 处理、药物激活补救激酶途径以及应用自由基清除剂等药物，然而这些治疗并不 能有效阻止心肌细胞的缺血再灌注损伤。因此，发现新的心肌保护措施是临床上 的重要课题，具有极为重要的公共卫生及社会意义。 ALDH2乙醛脱氢酶2(aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2)是已发现的ALDH 家族19个成员中对醛类代谢能力最强的同工酶，主要定位于心脏、肺脏、大脑 和肝脏的细胞线粒体内，而且它还是体内重要的氧化应激因子，除了能催化乙醛 代谢为乙酸外，还能催化其他具有毒性的活性醛类如4一羟基壬烯醛 (4-hydroxynonenal，4删E)、丙二醛等代谢为相应的无毒性的酸。研究证实过 表达ALDH2或者增加其活性可以有效的促进毒性醛的代谢、抑制线粒体的损伤以 及心肌细胞凋亡。以上研究均提示ALDH2可能为心肌保护新靶点。 细胞自噬(autophagy)是在细胞进化过程中，可以维持其内环境稳定的高度 保守的过程，是依赖溶酶体对细胞内的蛋白以及线粒体、内质网等细胞器进行降 解的重要途径。线粒体自噬(mitophagy)是一种可以选择性清除受损的线粒体从 而维持细胞内环境的稳定的特异性自噬。PINl【l／Parkin是线粒体自噬依赖的重 要的通路，在调控缺血再灌注损伤的过程中发挥着重要作用。已有大量的研究表 明，自噬及线粒体自噬是把双刃剑，适度的自噬可以促进细胞生存，然而过度的 自噬则可诱导细胞死亡，ALDH2则可以对自噬进行双向调控，从而发挥对心肌的 保护作用。 本课题旨在从线粒体自噬的调控方面对ALDH2发挥抵抗缺血再灌注损伤保 护心肌的具体机制进行系统的研究。 万方数据 山东大学博士学位论文目的 山东大学博士学位论文 目的 1．氧化应激损伤在缺血再灌注诱导的PINKl／Parkin依赖的线粒体白噬通路激活 过程中的作用和机制； 2．ALDH2对PINKl／Parkin依赖的线粒体白噬通路激活的调控和机制； 3．ALDH2对缺血再灌注诱导的心肌损伤的调控和机制。 研究方法 一、体内 1．建立大鼠缺血再灌注动物模型 首先将雄性Wistar大鼠随机分为为假手术组(SHAM)、缺血再灌注组 (I／R)、Alda-1干预组(I／R+Alda-i)和Daidzin干预组(I／R+Daidzin)，每 组12只。然后将大鼠进行麻醉、气管插管、呼吸机辅助呼吸，并且在结扎左冠状 动脉前降支前5min，对I／R+Alda一1和I／R+Daidzin组的大鼠心肌注射lOmg／kg Alda一1及lOOmg／kg Davidson。在此之后结扎前降支，造成心肌缺血，缺血30 min 后再将活结打开，血流再灌注120min。SHAM组大鼠除了不结扎前降支之外，其余 的过程均与I／R组相同。 2．TTC染色法测定I／R后大鼠各组的心肌梗死面积。 3．TUNEL法检测缺I／R后大鼠的各组心肌凋亡水平。 4．ALDH2活性测定：提取I／R后大鼠的心肌细胞线粒体蛋白与ALDH2底物乙醛或 丙醛反应。 5．蛋白印迹法(Western blot，WB)：各组大鼠刺激后处死收集心肌细胞，提取 心肌细胞总蛋白及线粒体蛋白，分别检澳tJPINKl、Parkin、COX IV、ALDH2、4HNE 和B-actin等蛋白的表达水平。 二、体外 1．建立H9C2心肌细胞缺氧复氧(hypoxia／reoxygenation，H／R)模型 首先将