基于芯片技术和cmap数据库筛选先天性巨结肠相关基因及潜在干预分子的研究-小儿外科学专业论文.docxVIP

优秀毕业论文 精品参考文献资料 博士学位论文253 博士学位论文 253个，其中在病变组织中下调基因有213个(211个显著，其中46个lncRNA)， 占84．19％：上调基因40个(31个显著，其中3个lncRNA)，占15．81％。获得 先天性巨结肠病变组织与正常组织差异基因表达谱。聚类分析显示，先天性巨 结肠病变组织的基因表达总体是较正常组织下调的，整体呈现退行性表达。 2、生物信息学分析 将这些差异表达基因分别按GO的生物学过程、细胞组成和分子功能进行 富集分析，发现多个重要基因功能的富集，涉及肌肉收缩、肌肉系统过程、G蛋 白偶联受体信号通路、离子转运、神经肽信号通路、平滑肌收缩、钙离子转运、 神经系统过程、细胞表面受体相关信号通路、突触传导等重要生物学过程或信 号通路；将差异表达基因通过查询KEGG等相关数据库进行通路分析，发现数 个重要通路的富集，涉及血管平滑肌收缩、钙离子信号通路、神经活性配体受 体相互作用等通路。 GO生物学过程分类中神经元分化调控和神经元投射发育调控这两个通路 可能与先天性巨结肠发病过程中ENCC的迁移、增殖和分化关系较为密切，两 者功能相近且差异基因有重叠，我们将之合并为神经元分化及投射相关信号通 路作为进一步研究的对象。芯片结果显示，神经元分化及投射相关信号通路里 的5个基因(PHOX2B，TLX2，CDH2，TNFRSFl2A，NEFL)均表达显著差异， 差异表达倍数分别为0．1 5，O．34，0．45，2．01，0．25。通过文献检索，已有研究 显示PHOX2B，TLX2，CDH2与先天性巨结肠发病机制有关，这进一步支持了 芯片检测的结果；而TNFRSFl2A，NEFL系首次发现的先天性巨结肠相关基因。 3、芯片结果的验证 为了验证神经元分化及投射相关信号通路的基因在先天性巨结肠病变组织 和正常组织中是否差异表达，同时也为了验证芯片结果的有效性和准确性，我 们选取了神经元分化及投射相关信号通路的3个基因(CDH2，TNFRSFl2A， NEFL)作为验证对象(由于已有报道显示PHOX2B，TLX2，CDH2与先天性巨 结肠发病机制有关，故仅选取其一CHD2作为验证对象；而TNFRSF 1 2A，NEFL 系首次发现的先天性巨结肠相关基因)，对8对先天性巨结肠病变组织和正常组 TTT 万方数据 摘要织进行 摘要 织进行RT-qPCR检测。结果显示，CDH2在病变组织中mRNA表达量较正常组 织明显下调，平均下调4．6倍(芯片结果2．2倍)；TNFRSFl2A在病变组织中 mRNA表达量较正常组织明显上调，平均上调2．3倍(芯片结果2．01倍)：NEFL 在病变组织中mRNA表达量较正常组织明显下调，平均下调14．9倍(芯片结果 4倍)。RT-qPCR验证结果与芯片结果一致。 应用免疫组化技术对上述3个基因(CDH2，TNFRSFl2A，NEFL)在先天 性巨结肠病变组织和正常组织中的蛋白表达进行验证，结果显示CDH2在病变 组织肌间神经纤维中呈阴性表达，而在正常组织肌间神经丛中呈中阳性表达； TNFRSFl2A在病变组织肌间神经纤维中呈强阳性表达，而在正常组织肌间神经 丛呈弱阳性表达：NEFL在病变组织肌间神经纤维中呈弱阳性表达，而在正常组 织肌间神经丛中呈强阳性表达。免疫组化结果与RT—qPCR和芯片结果基本一致。 四、结论 1、利用全基因组表达谱芯片研究先天性巨结肠的基因表达变化，发现先天性巨 结肠病变肠管组织与正常肠管组织间在基因的表达层面存在明显差异，病变组 织的基因表达总体是较正常组织下调的，整体呈现退行性表达。筛选得到的基 因及信号通路可能与先天性巨结肠的发生发展密切相关，可能在先天性巨结肠 发生发展过程中具有重要生物学功能：这需要进行更深入的分子水平研究，以 进一步探讨其在先天性巨结肠发生发展过程中的具体作用机制。 2、神经元分化及投射相关信号通路的基因表达在先天性巨结肠病变组织中明显 异常，其中PHOX2B，TLX2，CDH2已有报道显示与先天性巨结肠发病机制有 关，而TNFRSFl2A，NEFL系首次发现的先天性巨结肠相关基因，并利用常规 分子生物学技术从mRNA和蛋白水平得到验证，表明该信号通路可能参与先天 性巨结肠的发生发展过程。 3、基因芯片是一种高通量分析方法，可高效、可靠地筛选先天性巨结肠病变组 织与正常组织的差异表达基因，是了解先天性巨结肠相关基因的有效工具。本 研究筛选得到的先天性巨结肠相关基因和信号通路，为进一步揭示先天性巨结 IV 万方数据 博士学位论文 博士学位论文 肠发病机制并为寻找巨结肠相关生物标记物和探索潜在针对性干预措施提供了 理论基础和线索。 关键词：先天性巨结肠；基因芯片：表达谱；差异表达基因；信号通路；神经 元分化 第二部分