原核表达醛（糖）三四还原酶及霍乱毒素类似嵌合蛋白的研究.docxVIP

分类号： 分类号： 学校代号：11845 UDC： 密级： 学号：2111206036 广东工业大学硕士学位论文 (工学硕士) 原核表达醛(糖)还原酶及霍乱毒素类似嵌合 蛋白的研究 周小芬 指导教师姓名、职称： 鲎煜(数援2塾圭云(熬援2 学科(专业)或领域名称： 丝堂工程生撞盔 学生所属学院： ．经王丝王堂院 一 论文答辩日期： 星Q!互生鱼旦 万方数据 A A Dissertation Submitted to Guangdong University of Technology for the Degree of Master of Engineering Science (Master of Engineering Science) 洲Y ㈣2 Ⅲ，， 删9 咖5 川3 川8㈣9 Prokaryotic expression of aldose reductase，aldehyde reductasea and chimeric protein similar to cholera toxin Master Candidate：Zhou Xiaofen Supervisor：Prof．Zhang Kun June 2015 Faculty of Chemical Engineering and Light Industry Guangdong University of technology Guangzhou，Guangdong。P R．China，51 0006 万方数据 摘要摘要 摘要 摘要 本论文主要涉及了三个蛋白的基因克隆表达及相关抑制剂筛选的研究，主要包括 与糖尿病综合症及炎症相关的醛糖还原酶和醛还原酶，以及一种具有脑靶向作用的多 亚基全新的霍乱毒素类似嵌合蛋白的基因克隆表达和纯化，及采用醛糖还原酶和醛还 原酶进行抑制剂的筛选，主要得到的结果有以下三种。 第一，醛糖还原酶(Aldehyde reductase AKRlBt，ECl．1．1．21)是醛酮还原酶家族 成员，是多元醇通路的关键限速酶。越来越多的研究发现，AKRlBl与多种疾病有关， 在一系列的炎症性疾病等中起着关键作用，与多种炎症介质的产生有直接的关系，可 作为筛选非甾体抗炎药物的新靶点。为了筛选相应的酶抑制剂，为药物开发及临床应 用提供参考，本研究构建了重组表达质粒pET-22b．AKRlBl．(His)6，将该质粒转化至 Rosetta(DE3)宿主菌中，通过对表达条件的优化，确定表达条件为0．175 mMIPTG、14℃、 80 rpm诱导14h，重组蛋白以可溶和沉淀两种形式表达。采用亲和纯化得到纯度为93％ 的AKRlBl一(His)6融合蛋白。使用Western blotting蛋白质进行鉴定，蛋白质序列分析 仪测定氨基酸序列片段与目的蛋白序列比对。利用体外酶动学方法测定AKRlBl一(His)6 的比活力为(9．4+0．231 U／mg。使用该蛋白建立醛还原酶抑制剂筛选方法，分别测定已上 市的13种非甾体抗炎药(Non．Steroidal Anti—Inflammatory Drugs，NSAIDs)对 AKRlBl．(His)6的抑制活性。结果表明，萘普生、双氯芬酸、氟灭酸、布洛芬等对融 合蛋白AKRlBl一(His)6有较强的抑制作用，可与抗糖尿病并发症药物联合用药。 醛还原酶(Aldehyde reductase AKRlAl，ECl．1．1．2)是醛酮还原酶家族成员，能 将有毒醛还原成相应的醇。为研究非甾体抗炎药对AKRIAl的抑制作用，为非甾体抗 炎药的副作用及临床应用提供参考，本研究构建了重组表达质粒pET-22b一(His)。．DDDD K．AKRlAl，将该质粒转化至Rosetta(DE3)宿主菌中，通过对表达条件的优化，确定表 达条件为0．25 mMIPTG、16。C、80 rpm诱导14h，重组蛋白以可溶形式表达。采用亲 和纯化得到纯度为90％的pelB．(His)6．DDDDK—AKRlAl融合蛋白。重组蛋白用肠激酶 特异性剪切，经过Ni—NTA、Sephadex G．75再次纯化，得到纯度为98％的野生型AK R1A1蛋白。使用Western blotting和蛋白质序列分析对蛋白质进行鉴定。利用体外酶 动学方法测定(His)6一DDDDK—AKRlAl的比活力为(41．3士0．1)U／mg、AKRlAl比活力 万方数据 广东工业大学硕士学位论文为(79．4土0．15)U／mg。奥沙普秦、酮基布洛芬、氟灭酸、托芬那酸等对AKRlAl有很 广东工业大学硕士学位论文 为(79．4土0．15)U／mg。奥沙普秦、酮基布洛芬、氟灭酸、托芬那酸等对AKRlAl有很 强的抑制作用，为抗炎药副作用提供参考。 为了得到