龙须菜半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因的克隆和分析及其表达与琼胶合成的相关性研究-细胞生物学专业论文.docxVIP

优秀毕业论文 精品参考文献资料 龙须菜半乳糖-1- 龙须菜半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因的克隆和分 析及其表达与琼胶合成的相关性研究 摘要 龙须菜(Gracilaria／Gracilariopsis lemaneifotrois)是一种大型海藻，属于 红藻门，杉藻目，江蓠科。 龙须菜的分类地位一直存在争议，对于龙须菜属于Gracilariopsis属还是江 蓠属没有确定的答案。Gurgel(1991)就将江蓠科(Gracilariaceae)分成Melanthalia 和Curdiea，Gracilariopsis，Gracilaria三个不同属。本文对龙须菜居群内不同个体 的5．8S rDNA．ITS区进行了PCR扩增和序列分析，扩增DNA片段长度均为 1066bp，包含完整的rrsl(250 bp)、5．8S(159bp)和ITS2(657bp)，在青岛产龙 须菜的居群内不存在遗传差异；利用NCBI资源对江蓠属和Gracilariopsis属共 20个物种的rDNA-ITS相应序列进行了比较和系统进化分析，结果表明，龙须 菜和江蓠科19个物种中rDNA的5．8S区的长度和序列非常保守，而ITS区的 长度和序列则变异较大，20种江蓠科物种的遗传距离在0．013--0．596之间‘，龙 须菜在5．8S rDNA—ITS区特性上相比江蓠属物种与Gracilariopsis属物种更为相 似；采用UPGMA法构建了这20种江蓠科物种的系统发育树，分析结果表明青 岛产龙须菜应属于Gracilariopsis属，并且在江蓠科中较早分化，而龙须菜处于 Gracilariops属中比较古老的位置。 龙须菜最重要的经济意义在于所产的琼胶，因其高琼胶含量及质量受到越来 越多的关注。作为Gracilariopsis属内一种有重要经济价值的物种，利用分子生 物学手段开展龙须菜产琼胶相关基因的研究，从遗传物质DNA的角度直接、充 分地了解和研究龙须菜琼胶代谢机理和调控，无疑将为更好地开发和利用该经济 物种奠定坚实的基础。我们选取龙须菜琼胶合成过程中的关键酶一半乳糖．1．磷 酸尿苷酰转移酶(galactose一1-phosphate uridylyltransfemse，GALT)，根据相近物 种gait基因序列设计兼并引物，利用RT-PCR方法获得gait基因eDNA部分序列， 采用RACE方法分别获得gait eDNA的3’端序列，采用invitro cloning方法获 得gait基因5’端序列。根据所得结果拼接得到gait基因1240bp eDNA全长，序 5 列全长包括1086bp 列全长包括1086bp的开放阅读框和151bp 3’端非编码区，共编码362个氨基酸； 得到1447bp长的DNA序列，序列内没有内含子。rpsBLAST分析表明在C端和 N端都具有保守的Zn2十、Fe2+结合位点和能够引起酶失活的组氨酸三联体(HIT 元件)；此外，在氨基酸序列的166．175位点有一段高度保守的酶活性位点区。 Southern blotting结果显示gait基因在龙须菜基因组中只存在一个拷贝。 选取同一群体内的龙须菜，提取琼胶后，发现不同的藻株琼胶含量存在差距， 挑取其中相差较大的两组藻株提取RNA，反转录为eDNA后，用荧光实时定量 PCR的方法测定琼胶含量不同两组藻株解厅基因的表达，以2一△矗研法来处理数 据，表示目的基因的相对表达量。数据显示，琼胶含量与gait基因的表达存在 相关性，低琼胶含量的藻株galt基因的表达量低，高琼胶含量的藻株galt基 因的表达大部分较高，但由于GAIT蛋白量少、酶活性低或者琼胶合成路径中其 他酶的作用使得gait基因的表达与琼胶含量不成正比。半乳糖．1．磷酸尿苷酰转 移酶可能不是整个途径中的开关酶，藻体中琼胶含量的高低并不是由半乳糖．1． 磷酸尿苷酰转移酶直接控制。但我们的研究结果也显示了半乳糖一1．磷酸尿苷酰 转移酶基因与琼胶含量的高度相关性，将可开发作为龙须菜高琼胶含量的指标。 由于目前对江蓠属产琼胶品种的琼胶合成路径缺乏系统的研究，对整个碳代谢尤 其是琼胶合成过程了解的还很有限，因此筛选出对琼胶合成起关键作用的酶系并 对其进行分析利用，需要进一步的研究。 关键词：龙须菜 rDNA-ITS系统学 琼胶合成琼胶含量 半乳糖．1． 磷酸尿苷酰转移酶基因 6 Stud Stud i es on the C l on i ng and ana I ys i S of ga I actose一1一phosphate ur i dy I Y Itransferase gene of GracI lar|opS|S／emaneI?orm／S and the corre、at 1 0n bet