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微生物实验技术（一） 一、显微镜技术 光学显微镜技术 普通光学显微镜技术 相差显微镜技术 荧光显微镜技术 电子显微镜技术 1.普通光学显微镜技术（light microscopy） 结构 光学放大系统：物镜（油镜、高倍镜和低倍镜）和目镜（10×、16×） 照明系统：光源、反光镜和聚光器 机械和支架系统 分辨率 分辨率：指区分开两个质点间的最小距离。 D = 0.61λ/ (n·sinθ) D：分辨率 λ：波长 n：物镜与物体间介质折射率 2θ：物镜镜口角 N.A：即n·sinθ，数值孔径 2θ最大值 = 140℃，空气中n = 1，最短的可见光波长λ = 450nm，分辨率D = 292nm，约0.3um 油镜：n = 1.52，D = 0.2um 普通光镜的最大分辨率D = 0.2um 2. 相差显微镜技术（phase-contrast microscopy） 相差显微镜与普通显微镜的区别： 在物镜后装有一块“相差板”，偏转的光线分别通过相差板的不同区域，由于相差板上部分区域有吸光物质，使两组光线之间增添了新的光程差，从而对样品不同密度造成的相位差起“夸大”作用。最后这两组光线经过透镜又会聚成一束，发生互相叠加或抵消的干涉现象，表现出肉眼可见的明暗区别。 相差显微镜将光程差或相位差转换为振幅差，即明暗差别。相差显微镜的样品不需染色，可以观察活细胞及细胞内的某些细微结构。 光线通过不同密度的物质时，其滞留程度也不同，密度大则光的滞留时间长，密度小则滞留时间短。 3. 荧光显微镜技术(fluorescence microscopy) 仪器：点光源（高压汞灯），滤色系统 原理：荧光物质，激发光，发射光 利用一个高发光效率的点光源（高压汞灯），以最小表面释放出最大数量的紫外光（365nm）和蓝紫光（420nm），经过滤色系统，作为激发光，激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜（石英玻璃制成）的放大进行观察，这种荧光在显微镜下很容易辨认，敏感性高，能对细胞的特定物质进行定性、定位和定量观察。 荧光： 自发荧光：通过激发光使物体发出荧光，如叶绿素、维生素A 诱发荧光：通过诱导剂作用而发出的荧光，如甲醛蒸汽处理诱发细胞和组织中生物单胺类产生荧光 荧光染料染色荧光：丫啶橙对细胞DNA、RNA同时染色后，DNA呈绿色荧光，RNA呈橙色荧光。 4. 电子显微镜技术（electron microscopy） 原理：使用波长比可见光短得多的电子束作为光源（波长一般小于0.1nm），用电磁透镜聚焦，电镜镜筒中要求高真空，图象需用荧光屏来显示或感光胶片作记录。 分辨率：0.2nm；放大倍数106倍。 人眼分辨率0.2mm；光学显微镜分辨率0.2um，放大倍数1000倍。 基本构造 电子束照明系统：电子枪、聚光镜 成像系统：物镜、中间镜、投影镜 真空系统：用两级真空泵抽气，保持电子枪、镜筒及记录系统内的高真空。 记录系统：用荧光屏显示或感光胶片作记录。 电子显微镜与普通光学显微镜的基本区别 分辨本领 光源 透镜 真空 成像系统 光学显微镜 200nm 可见光 玻璃透镜 不要求 利用样品对光的吸收形 (λ:400-700nm) 成明暗反差和颜色变化 100nm 紫外光 玻璃透镜 不要求 (λ约200nm) 电子显微镜 约0.1nm 电子束 电磁透镜 1.33×10-5~ 利用样品对电子的散 (λ:0.01~0.9nm) 1.33×10-3Pa 射和透射形成明暗反