分子生网物实验技术.ppt

扩增片段大小 ★ 80-150bp(尽量限制在300bp以内) Primer长度 ★ 17-25base GC含量 ★ 40-60%(最好45-55%) Tm值 ★ ★ ★ 两条引物的Tm值尽量接近，引用专用软件计算Tm值 序列 ★ 整体上碱基不能过偏 个别部分避免GC rich或AT rich(特别是3’端) 避免T/C连续，A/G连续 3’末端序列 ★ 3’末端避免GC rich或AT rich 3’末端碱基最好为G 或C 3’末端碱基尽量避免为T 互补性 ★ ★ ★ 引物内部或两条引物之间避免3base以上的互补序列 引物3’末端避免2base以上的互补序列 特异性 ★ ★ ★ 使用BLAST检索，确认引物特异性 Real Time PCR用引物设计原则 ★号表示重要程度，★号越多，表示该参数越重要，设计时要优先考虑 Real time PCR的标准样品 绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒DNA 相对定量中的内标： ---内标通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因 ---在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小 ---内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量 标准样品DNA拷贝数 用于生成标准曲线的样品浓度如何设定？ ---含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒 ---含有和待测样品相同扩增片段的cDNA ---紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度 ---根据质粒或cDNA分子量换算成拷贝数，做系列稀释 标准曲线制作 扩增曲线 106 105 104 103 102 101 标准曲线 106 105 104 103 102 101 标准品梯度的选择：5～6个梯度 标准品稀释倍数的选择：标准品稀释倍数通常为10 基线平整 Negative control为水平线 指数区较明显，陡度大 平台区汇于一起 线性范围宽 理想的标准品扩增曲线 29.53 11.92 15.21 19.02 22.33 26.21 32.45 理想的标准曲线 相关系数（r2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。 扩增效率（E）：0.8-1.2, 越接近1，越理想。效率低于100%，是由于PCR反应中存在抑制因素，而高于100%，可能是一些污染，非特异性扩增或者引物二聚体造成 相关系数 斜率 扩增效率（E）计算方法 标准曲线X轴表示起始模板浓度（log10)，Y轴表示Ct值时 E=10-1/a-1 标准曲线X轴表示Ct值，Y轴表示起始模板浓度（log10) E=10-a-1 SYBR Green I 熔解曲线分析 温度 荧光强度 Tm Tm值：DNA解链一半时的温度 SYBR Green I 熔解曲线分析 将温度与荧光强度的变化求导。(dI/dT) -dI dT Tm 特异性产物 非特异产物 引物二聚体 对PCR产物特异性进行分析 融解曲线分析 单一峰 无非特异性荧光 定量准确 出现杂峰 其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确 出现杂峰 引物二聚体出现非特异性荧光，因此定量不准确 SYBR Green 法应用范围 起始模板的测定 基因型的分析 融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。 * 2、变性梯度凝胶电泳 变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最初是Lerman等人于20世纪80年代初期发明的，起初主要用来检测DNA片段中的点突变。 该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。 双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。 DGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。 原理 不同的双链DNA片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域及各解链区域的解链温度也是不一样的。 同样长度但序列不同的DNA片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链温度，因此它们会在胶中的不同位置处发生部分解链导致迁移速率大大下降，从而在胶中被区分开来。 然而，一旦温度（或