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免疫组织化学技术 免疫组织化学酶类标记物 满足条件： 酶催化底物必须是特异的，并容易被显示（产物易于镜下观察）； 酶反应形成的终产物必须是稳定的沉淀，不能从酶活性部位向周围组织弥散； 容易获取（纯）； 中性pH值时，具有稳定性； 酶标记至抗体上不影响酶和抗体的活性。 常用酶类标记物 辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）H2O2和DAB（diaminobenzidine, 二氨基联苯胺）为其常用底物，产物为稳定的棕黄色沉淀 切 片 载玻片的清洁： 切片粘合剂的使用：（1）多聚赖氨酸（分子量300KD）：0.5%浓度涂片。（2）APES 干净载玻片→丙酮5min →用镊子夹住浸入APES试剂（1ml+50ml丙酮） 1～3次→纯丙酮洗二次→干燥玻片(37℃过夜)→用铝箔包好，室温或4℃保存备用。 （3）铬矾明胶液：铬矾0.5g 明胶5g H2O 1000ml 细胞爬片制作 将处理好的盖玻片放入接种了细胞的培养瓶或六孔板内。 待细胞生长达到60％以上后取出玻片。 用4%的多聚甲醛固定2h以上。 可加甘油封存置于零下20度保存。 细胞涂片制作 离心将细胞收集出来，用预冷的PBS洗2－3遍，最后用PBS将细胞重悬。 吸取30－50ul（可根据细胞量调整）滴至处理过的载玻片上，然后涂抹均匀。 待稍微风干以后加4％多聚甲醛溶液覆盖细胞，固定2－4小时。 在细胞上加一层甘油放-20℃保存。 抗原修复 高压加热修复法① 切片脱蜡至水;② 0.3% H2O2甲醇处理切片10min;③ 蒸馏水洗;④ 切片放入0.01M 柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）中，连同容器放入高压锅中加热至沸腾。盖上压力阀至喷汽后持续1－4min;⑤ 待修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学染色方法进行染色。 电炉加热修复法① 切片脱蜡至水;② 0.3% H2O2甲醇处理切片10min;③ 蒸馏水洗;④ 将切片放入抗原修复液中于电炉上加热，不时用温度计测量温度，当达92℃后，即可拔离电源，当温度低于92℃时，再插上电源，如此反复持续至10min左右;⑤ 待抗原修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选定的免疫组化染色方法进行染色。 微波修复法① 切片脱蜡至水;② 0.3%H2O2甲醇处理10min;③ 蒸馏水洗;④ 0.01M柠檬酸盐缓冲液（pH6.0），于微波炉内微波辐射10min;⑤ 待修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学染色方法进行染色。 胃蛋白酶消化法① 切片脱蜡至水;② 0.3% H2O2甲醇处理切片10min;③ 蒸馏水洗;④ PBS洗3次;⑤ 滴上配制好或商品化的胃蛋白酶，处理切片20min左右;⑥ PBS冲洗3次;⑦ 按选择好的免疫组化该法进行染色。 胰蛋白酶消化法① 切片脱蜡至水;② 0.3% H2O2甲醇处理切片10min;③ 蒸馏水洗;④ PBS洗3次;⑤ 滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，处理切片20min左右;⑥ PBS洗3次;⑦ 按选好的免疫组化染色方法进行染色。 注意事项 一、抗体的保存 浓缩抗体：有效期内，只需放在 4℃冰箱内，保存时间可达1-3年。 即用型抗体：理论上在4℃冰箱内 可保存半年左右。 PBS或抗体稀释液稀释的抗体：一般 只可放置1-2个月。 三、出现假阴性的原因 固定时间过长，浸蜡、烤片温度过高，导致抗原丢失，无法补救。 固定液不合适或浓度不对，导致固定不佳。最好使用10%中性福尔马林。 抗体浓度过低。 孵育时间太短，或孵育温度太低。 缓冲液pH值不正确。 四、必须严格设置阳性对照和阴性对照。 五、DAB有致癌性，用后不应随处倒弃。 1. Antigen retrieval Proteolytic enzyme method and Heat-induced method 2. Inhibition of endogenous tissue components 3% H2O2, 0.01% avidin 3. Blocking of nonspecific sites 10% normal serum Controls Positive Control It is to test for a protocol or procedure used. It will be ideal to use the tissue of known positi