分子生物英学许晓东5.pptVIP

5 分子生物学研究方法（上） ——DNA、RNA及蛋白质操作技术; 从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速发展，主要原因之一是研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步。 基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。;基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。 基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。 事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。;5.1 重组DNA技术回顾;;;;质粒是真核细胞细胞核外或原核生物拟核区外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶绿体）中和细菌细胞拟核区以外的环状脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体DNA以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体(Vector)。 严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒。 松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞 内一般有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理（如氯霉素）抑制寄主蛋白质的合成还 会使质粒拷贝数增至几千份。 功能：进行细胞间接合，并带有一些基因，如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等。;一个质粒实例;限制性内切酶;双酶切;单酶切;去磷酸化防止自连;NcoI BspHI PciI BsaI;;转化 外源DNA的进入而使细胞遗传性改变称为转化。早在1943年，Avery等就发现有毒肺炎双球菌的DNA与无毒肺炎双球菌共培养后产生有毒性的肺炎双球菌后代的转化现象。 由于天然状态下DNA进入细胞的效率很低，在分子生物学和基因工程工作中可采取一些方法处理细胞，经处理后的细胞就容易接受外界DNA，称为感受态细胞，再与外源DNA接触，就能提高转化效率。 例如大肠杆菌经冰冷CaCl2的处理，就成为感受态细菌，当加入重组质粒并突然由4℃转入42℃作短时间处理，质粒DNA就能进入细菌；用高电压脉冲短暂作用于细菌也能显著提高转化效率，这称为电穿孔（electroporation）转化法。;将连接有所需要的DNA的载体导入宿主细胞的常用方法有四种： ①转化，用质粒作载体所常用的方法。 ②转染，用噬菌体DNA作载体所用的方法，这里所用的噬菌体DNA并没有包上它的外壳。转染是转化的一种特殊形式。 ③转导，用噬菌体作载体所用的方法，这里所用的噬菌体DNA被包上了它的外壳，不过这外壳并不是在噬菌体感染过程中包上，而是在离体情况下包上的，所以称为离体包装。 ④注射，如果宿主是比较大的动植物细胞则可以用注射方法把重组DNA分子导入。 ;;核酸凝胶电泳技术 细菌转化与目标DNA分子的增殖 聚合酶链反应技术 实时定量PCR 基因组DNA文库构建;5.2.1 核酸凝胶电泳技术;准备胶板;上样;;溴化乙锭 由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。;DNA的迁移速度与构型有关;聚丙烯酰胺凝胶电泳;DNA双脱氧法测序原理;普通的琼脂糖凝胶电泳，很难分离大于50kb的DNA分子，而要进行超大分子研究，要用到脉冲电场凝胶电泳;脉冲电场凝胶电泳原理;脉冲电场凝胶电泳效果;5.2.2 细菌转化与目标DNA分子的增殖;电转化仪;利用噬菌体颗粒能够有效将DNA注入到宿主细胞这一特点，科学家又发明了DNA分子的体外包装法;延伸：其他基因导入方法;蓝白斑筛选;5.2.3 聚合酶链反应技术;变性;PCR引物设计： ①引物的长度一般为15-30 bp。②引物在模板内最好具有单一性，特别是3’端。③引物序列的GC 含量最好在40％一60％，且上下游引物序列GC含量的差异不要太大。④避免形成稳定的引物二聚体和发夹结构 。 ;聚合酶（Taq酶）;RT-PCR (反转录PCR);5.2.4 实时定量PCR;;TaqMan荧光探针;5.2.5 基因组DNA文库的构建;用λ噬菌体建立DNA文库示意图 其他载体： bacterial artificial chromosome (BAC) p1 artificial chromosome (PAC) yeast artificial chromosome (PAC);5.3 RNA基本操作技术;5.3.1 总RNA的提取;5.3.2 mRNA的纯化;5.3.3 cDNA的合成;;5.3.4 cDNA文库的构