近视眼发病机制的研究——视黄酸对巩膜成纤等维细胞基因表达的影响.docxVIP

近视眼发病机制的研究——视黄酸对巩膜成纤维细胞基因表达的影响 近视眼发病机制的研究——视黄酸对巩膜成纤维细胞基因表达的影响 中山大学博士学位论文 第一部分 透镜诱导豚鼠屈光不正的实验研究 目的：观察凹透镜和凸透镜对豚鼠眼球生长和屈光变化的影响，建立透镜 诱导型屈光不正动物模型，探讨CRALBP在实验性近视眼巩膜中的作用。 方法：3~4周龄有色豚鼠47只，随机分成7组，右眼分别戴不同度数的凸 或凹透镜，其左眼作为对照眼，戴镜前和戴镜后第ll天分别测量其眼轴长度、 屈光度，观察其变化。用HE染色测量诱导近视眼巩膜和对照眼巩膜的厚度变化。 通过免疫组化和蛋白质免疫印迹的方法检测CRALBP在豚鼠诱导近视眼和对照 眼的视网膜、脉络膜和巩膜的表达。 结果：戴镜后第11天，与戴镜前相比，戴+4．00D、+8．00D组的豚鼠眼分 别增加了+1．46D与+1．58D的相对远视(尸0．05)：戴-4．00D、．8．00D、．15．00D 组的豚鼠分别增加了．2．92D、．3．17D、．3．10D的相对近视(尸0．01)：而戴0．00D、 一2．00D组的豚鼠的屈光度差异无统计学意义(户0．05)。所有七组豚鼠的眼轴长 度在实验眼和对照眼之间差异无统计学意义(尸0．05)。分别将对照眼和透镜诱 导近视眼后极部巩膜HE染色，结果显示诱导近视眼巩膜比对照眼巩膜变薄。免 疫组化结果显示，和对照眼相比，诱导近视眼的CRALBP在脉络膜和巩膜中的表 达明显降低，在视网膜中的表达升高。Western blotting结果和免疫组化结果 相对应，CRALBP在诱导近视眼巩膜中的表达明显降低。 结论：豚鼠眼球生长发育受透镜影响，可被用来建立一种简单经济的屈光 不正动物模型。和对照眼相比较，诱导近视眼巩膜变薄。CRALBP在眼球发育以 及近视眼形成过程中可能参与了RA的转运与调节。 ．Ⅱ． 近视眼发病机制的研究——视黄酸对巩膜成纤维细胞基因表达的影响 近视眼发病机制的研究——视黄酸对巩膜成纤维细胞基因表达的影响 中山大学博士学位论文 第二部分 视黄酸对体外人巩膜成纤维细胞影响的研究 目的：探讨全反式视黄酸(all—trans retinoic acid at—RA)对培养的 人巩膜成纤维细胞(human scleral fibroblasts HSF)的形态、增殖以及细胞 周期的影响，从而探讨at—RA在近视眼巩膜重塑中的作用。 方法：HSF传代至第四代后以1 X 105／孔的密度接种于96孔板或以1 X 106的 密度接种于25cm2的培养瓶，以含IO％FBS的DMEM／F12培养液培养，当细胞长满瓶 子80％--90％时，培养液转换为含浓度为5×10～、l X 10葡、2×10—5M，5×10一5M at-RA的DMEM／F12。以未加RA组作正常对照，于12、24、48、72小时后观察HSF 形态；96孔板以浓度1 X 10～，1 X 10一‰，l×10啊，l×lO一7M，1×lO‘8M at—RA作 用HSF24、48、72小时后用MTT法测定其增殖情况；以浓度5×10～、1 X 10翱的at-RA 作用于HSF，24、48d,时后用FCM检测细胞周期情况。 结果：不同at—RA的剂量对HSF的形态、增殖有程度不同的负性影响。At—RA 刺激后HSF细胞数目减少，细胞收缩，突起减少，部分裂解，胞浆内有空泡和颗粒 形成，细胞之间的间隙增宽，细胞变得细长，呈束状或不规则排列。在高浓度(1 ×10一‰)时，细胞大部分裂解，看不到完整的细胞存在，只有裂解的碎片。MTT 法显示at—RA对巩膜成纤维细胞有明显的抑制作用，该效应呈剂量依赖性反应。 FCM结果显示经at—RA刺激HSF24、48d,时后，和对照组比较，随着at—RA浓度和时 间的增加，GO／G1期细胞的比例逐渐上升，而S期和G2期细胞比例相应下降，细胞 被阻滞在GO／G1期。 结论：RA可以抑制体外培养的人巩膜成纤维细胞增殖和DNA合成，RA的浓度 变化最终引起巩膜成纤维细胞形态和功能的改变。RA可能是近视发生过程中的信 使物质。 ．ⅡI． 近视眼发病机制的研究——视黄酸对巩膜成纤维细胞基因表达的影响 近视眼发病机制的研究——视黄酸对巩膜成纤维细胞基因表达的影响 中山大学博士学位论文 第三部分 视黄酸对人巩膜成纤维细胞中CRABP、CRALBP、MMP-9 和TIMP-1表达的影响 目的：利用基因芯片技术筛选RA培养HSF后相关基因群的表达变化，以探 讨RA作用于HSF的相关通路。用不同浓度RA培养HSF后，HSF表达CRABP、CRALBP、 MMP-9和TIMP-1的变化，以从分子水平解释RA的作用机制。 方法：HSF传代至第四代后以l X 106的密度接种于25cm2的培养瓶，以含 10％F